Shh-BMP4信號在先天性肛門直腸畸形中表達(dá)的研究.pdf

1、先天性肛門直腸畸形是胚胎期后腸末端發(fā)育異常的一類疾病的總稱，病變涉及肛門、直腸、尿道及外生殖器，是小兒最常見的消化道畸形，雖經(jīng)治療卻常有不同程度的后遺癥，嚴(yán)重危及患兒生命和生活質(zhì)量，因此，對其發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的意義。
　　 本研究包括動物實(shí)驗(yàn)和人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)兩部分內(nèi)容：①ETU誘導(dǎo)大鼠胚胎肛門直腸畸形的演變與Shh/BMP4表達(dá)的關(guān)系的研究：用ETU致畸Wistar大鼠胚胎，觀察畸形發(fā)生過程中的病理形態(tài)學(xué)變化并檢測Shh/B

2、MP4信號通路中的三個關(guān)鍵基因Shh、Gli2和BMP4在泄殖腔及直腸的表達(dá)模式和水平，從而探討Shh/BMP4信號與肛門直腸畸形發(fā)生的關(guān)系。②Shh/BMP4信號在人類先天性肛門直腸畸形中表達(dá)的研究：檢測肛門直腸畸形患兒直腸末端Shh/BMP4信號的表達(dá)狀況，探討這些基因與人類先天性肛門直腸畸形的關(guān)系，為尋找人類先天性肛門直腸畸形的致病基因提供線索。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 實(shí)驗(yàn)動物：Wi

3、star大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　 病例標(biāo)本：收集在我院手術(shù)治療的肛門直腸畸形病人40例，其中低位畸形25例，高位畸形15例，男27例，女13例，平均年齡1.5個月。收集非胃腸道疾病死亡如新生兒窒息、顱內(nèi)出血等10例為對照組，其中男6例，女4例，平均年齡1.0個月。標(biāo)本處理：無菌條件下取直腸末端后壁腸組織，置于-75℃冰箱中保存。
　　 試劑及實(shí)驗(yàn)儀器：①試劑：ETU購于Sigma公司，Shh、G

4、li2和BMP4多克隆抗體購于Santa Cruz公司，SP試劑盒購于邁新公司，TRIZOL試劑、RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，引物由Invitrogen英駿生物技術(shù)有限公司合成。②儀器：NiKon Eclipse Esoo光學(xué)顯微鏡，NIS-Elements F2.30圖像采集軟件，UV-3000型紫外分光光度計，PTC-200TM型PCR擴(kuò)增儀，天能公司GIS-2020型凝膠成像分析系統(tǒng)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法

5、>　　 1、ETU誘導(dǎo)大鼠胚胎肛門直腸畸形的演變與Shh/BMP4表達(dá)的關(guān)系的研究。①動物模型的建立：實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為ETU組和對照組。在妊娠第10天時給ETU組孕鼠經(jīng)胃管注入1％ETU，用量為125 mg/kg；對照組給予等量的生理鹽水。分別于妊娠第12.5、13.5、14、15和16天共5個時間點(diǎn)剖宮取仔。②Shh、Gli2和BMP4免疫組化染色：對照組和ETU組的各時間組各取3只孕鼠，胎仔置于4％多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)酒精脫水

6、、石蠟包埋，所得標(biāo)本矢狀位連續(xù)切片，切片厚度4μm，然后取正中矢狀位切片行免疫組化染色。③RT-PCR實(shí)驗(yàn)：對照組和ETU組的各時間組各取2只孕鼠，檢測胚胎泄殖腔部分Shh、Gli2和BMP4的表達(dá)水平。④Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)：胎齡16天時，對照組、ETU致畸形組和未致畸形組各為30只胎仔，取其直腸檢測Shh、Gli2和BMP4的蛋白表達(dá)。
　　 2、Shh/BMP4信號在人類先天性肛門直腸畸形中表達(dá)的研究。直腸標(biāo)本的石蠟

7、切片免疫組化染色、RT-PCR和Western蛋白印跡方法檢測Shh、Gli2和BMP4基因在40例肛門直腸畸形病人和10例無畸形兒直腸末端的表達(dá)狀態(tài)。
　　 3、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)值以x±s表示，用SPSS13.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、ETU誘導(dǎo)大鼠胚胎肛門直腸畸形的演變與Shh/BMP4表達(dá)的關(guān)系的研

8、究
　　 免疫組化染色：組織切片觀察ETU組63.2％胚胎發(fā)生肛門直腸畸形，對照組未見明顯畸形，證實(shí)本組畸形穩(wěn)定。鼠胚泄殖腔正常發(fā)育的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：胚胎12.5天到14天主要以泄殖腔形態(tài)變化為特征，同時可見生殖結(jié)節(jié)的迅速生長。胚胎14天到16天主要以尿直腸隔下降并與泄殖腔膜融合為主要特征。ETU組畸形鼠胚的泄殖腔發(fā)育主要有兩個異常：一是在發(fā)育早期泄殖腔形態(tài)的異常，導(dǎo)致尿直腸隔的位置很高不能有效分隔泄殖腔；二是尿直腸隔下降障礙，未與

9、泄殖腔膜融合，直腸和泌尿生殖道間存在共同通道而不能完全分離。Shh/BMP4信號在泄殖腔的表達(dá)模式：Shh和Gli2表達(dá)在泄殖腔、膀胱、尿道、直腸和肛門的上皮細(xì)胞，胞漿內(nèi)呈淺棕色顆粒。BMP4的表達(dá)位于尿直腸隔內(nèi)和泄殖腔、直腸、膀胱和尿道周圍的間質(zhì)細(xì)胞和胞外間質(zhì)中，為胞漿及胞外間質(zhì)染色，也呈淺棕色顆粒。在對照組胚胎14天，BMP4在尿直腸隔內(nèi)及直腸周圍表達(dá)最強(qiáng)。ETU致畸組Shh、Gli2和BMP4的表達(dá)較對照組明顯減弱甚至缺乏。

10、>　　 RT-PCR實(shí)驗(yàn)：Shh、Gli2和BMP4 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，分別于預(yù)期的187bp、158bp和493bp處見條帶，提示有Shh、Gli2和BMP4的mRNA表達(dá)。β-actin在各反應(yīng)體系中擴(kuò)增結(jié)果一致，證實(shí)PCR反應(yīng)基本真實(shí)地反映了各基因的表達(dá)。在對照組的胚胎12.5-14天，Shh/BMP4mRNA的表達(dá)水平較高，在胚胎15-16天時略有下降；在ETU組，Shh/BMP4mRNA的表達(dá)水平均低于對照組，其中S

11、hh和Gli2在胚胎12.5-14天、BMP4在胚胎14-16天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 Western蛋白印跡：對照組和ETU兩組均出現(xiàn)被Shh、Gli2和BMP4抗體識別的顯色帶，其中對照組和ETU未致畸形組表達(dá)強(qiáng)度相似，對照組Shh、Gli2和BMP4蛋白的相對含量(1.127±0.13、1.527±0.16和0.980±0.05)與ETU未致畸形組(1.070±0.19、1.490±0.05和0.926

12、±0.15)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均大于0.05)。但ETU致畸形組Shh、Gli2和BMP4的條帶明顯減弱甚至消失，其蛋白的相對含量(0.886±0.09、1.06±0.08和0.913±0.04)與對照組和ETU未致畸形組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均小于0.05)。
　　 2、Shh/BMP4信號在人類先天性肛門直腸畸形中表達(dá)的研究
　　 免疫組化染色：Shh、Gli2表達(dá)在腸壁粘膜細(xì)胞的胞漿中，為棕黃色顆粒；BMP4表達(dá)

13、在粘膜下層的間質(zhì)細(xì)胞中，為胞核、胞漿著色，呈棕黃色顆粒。對照組和低位畸形組Shh、Gli2和BMP4均有明顯染色，而在高位畸形組各基因的染色明顯減弱。
　　 RT-PCR檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，顯示條帶亮度各不相同。在高位畸形組，Shh、Gli2和BMP4 mRNA擴(kuò)增條帶多呈弱帶或無帶，在低位畸形組及對照組多呈亮帶。半定量分析Shh、Gli2和BMP4 mRNA含量：高位畸形組的各值(0.63±0.27，0.23±0.08和0

14、.694±0.25)比較低位畸形組(0.89±0.39，0.81±0.32和0.98±0.33)和對照組(0.91±0.71，1.24±0.38和1.11±0.45)明顯下降(P<0.05)；而在低位畸形組，除Gli2外，Shh和BMP4的表達(dá)與對照組無明顯差異(P>0.05)。
　　 Western蛋白印跡：各組與Shh、Gli2和BMP4抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)在硝酸纖維膜上均呈現(xiàn)出條帶，但各組、各基因表達(dá)的信號強(qiáng)弱不同。Shh、G

15、li2和BMP4蛋白的相對含量在高位畸形組分別為0.920±0.09、1.106±0.11和1.070±0.10，在低位畸形組分別為1.317±0.13、1.210±0.10和1.137±0.14，在對照組分別為1.586±0.08、1.430±0.09和1.520±0.08。統(tǒng)計學(xué)分析顯示：高位畸形組比較低位畸形組和對照組各基因的蛋白表達(dá)量均有顯著性下降(P<0.05)，而低位畸形組與正常組比較，各基因的蛋白表達(dá)量無顯著性差異(P>0

16、.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在大鼠胚胎發(fā)育過程中，Shh/BMP4信號表達(dá)在泄殖腔及直腸區(qū)域，調(diào)節(jié)泄殖腔及直腸的正常發(fā)育。
　　 2、ETU組鼠胚的泄殖腔和直腸的Shh/BMP4信號表達(dá)下降表明ETU擾亂了Shh/BMP4信號表達(dá)。
　　 3、在泄殖腔發(fā)育過程中，ETU組畸形鼠胚的泄殖腔區(qū)Shh/BMP4信號表達(dá)水平下降，從而使泄殖腔不能正常發(fā)育，可能是導(dǎo)致肛門直腸畸形發(fā)生的重要因素之一。