Hoxd-13在肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸發(fā)育中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：先天性肛門(mén)直腸畸形(Anorectal Malformations，ARMs)是最常見(jiàn)的消化道畸形。病理改變非常復(fù)雜，且疾病譜廣，表型多種多樣，遺傳方式不清楚，病因及胚胎形成機(jī)制至今未完全闡明。因此，從胚胎學(xué)和分子生物學(xué)探索先天性肛門(mén)直腸畸形的發(fā)病機(jī)制和致病基因具有十分重要的意義。近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Hoxd-13基因與先天性肛門(mén)直腸畸形的發(fā)生有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和RT-PCR方法，觀察Hoxd-13在正常和乙

2、烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，旨在探討Hoxd-13基因在先天性肛門(mén)直腸畸形發(fā)生機(jī)制中的作用。 材料與方法： 一、肛門(mén)直腸畸形動(dòng)物模型的建立 應(yīng)用乙烯硫脲致畸制作Wistar大鼠肛門(mén)直腸畸形動(dòng)物模型(n=20)。成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10)，經(jīng)胃管按125mg/kg體重投以1％ETU，對(duì)照組投以等量的生理鹽水。分別在大鼠

3、妊娠第13天、14天、15天、16天、18天、21天剖宮取胎。一部分標(biāo)本備石蠟切片免疫組化染色之用，另一部分標(biāo)本備RT-PCR之用。 二、HOXd-13石蠟切片免疫組化染色大鼠胚胎標(biāo)本 經(jīng)4％多聚甲醛固定、脫水后制成蠟塊，行矢狀面連續(xù)切片，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察胎齡13～21天(E13～21)正常及肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸的形態(tài)學(xué)變化過(guò)程。選正中矢狀面石蠟切片進(jìn)行Hoxd-13免疫組織化學(xué)染色，連續(xù)動(dòng)態(tài)對(duì)比觀察Hoxd-13在

4、正常和肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。 三、Hoxd-13 mRNA RT-PCR 在解剖顯微鏡下應(yīng)用手工顯微切割方法準(zhǔn)確切取泄殖腔/后腸標(biāo)本，提取總RNA，通過(guò)RT-PCR方法研究Hoxd-13 mRNA在正常和肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)狀況。 結(jié)果： 一、連續(xù)石蠟切片觀察形態(tài)學(xué)變化過(guò)程 在正常大鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，觀察到尿直腸隔進(jìn)行性下降，與泄殖腔膜之間的距離

5、越來(lái)越小，直至E15，尿直腸隔與泄殖腔膜融合，使腹側(cè)的尿生殖竇與背側(cè)的后腸完全分離。E16，肛膜破裂，直腸與外界相通。而在肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，與同齡正常大鼠胚胎相比，尿直腸隔發(fā)育較差，與泄殖腔膜之間的距離較大，E15未觀察到二者融合，E16-21觀察到直腸尿道瘺(泄殖腔畸形)的存在。 二、Hoxd-13免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (一)Hoxd-13表達(dá)的部位正常大鼠胚胎中,Hoxd-13陽(yáng)性區(qū)域主要分布于尿直腸隔

6、的間質(zhì)以及后腸、泄殖腔膜或肛管/瘺管和尿生殖竇的上皮層。肛門(mén)直腸畸形組的大鼠胚胎，陽(yáng)性區(qū)域主要集中于尿生殖竇上皮層。 (二)Hoxd-13表達(dá)的水平在兩組大鼠胚胎中，Hoxd-13平均光密度值隨著胎齡的增長(zhǎng)呈總體增加的趨勢(shì)，>E16表現(xiàn)明顯。與對(duì)照組比較，肛門(mén)直腸畸形組大鼠胚胎尿直腸隔間質(zhì)、后腸上皮層、泄殖腔膜或肛管(瘺管)上皮層平均光密度值明顯減小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E18和E21，比較無(wú)明顯差異。Hoxd-13在

7、肛門(mén)直腸畸形組各胎齡大鼠胚胎尿生殖竇上皮層平均光密度值較對(duì)照組無(wú)明顯差異。 三、Hoxd-13 mRNA RT-PcR半定量檢測(cè)結(jié)果 在正常和肛門(mén)直腸畸形大鼠胚胎肛門(mén)直腸中均能檢測(cè)出Hoxd-13基因的表達(dá)，Hoxd-3mRNA擴(kuò)增條帶在ARMs組呈弱帶或無(wú)帶，在對(duì)照組均呈亮帶。其相對(duì)表達(dá)量隨著胎齡的增長(zhǎng)呈總體增加的趨勢(shì)，>E16明顯增強(qiáng)．E13-16，肛門(mén)直腸畸形組Hoxd-13基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

8、異(P<0.05)。E18和E21，兩組比較無(wú)明顯差異。RT-PCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。 結(jié)論： Hoxd-13在E13-16肛門(mén)直腸畸形與正常大鼠胚胎肛門(mén)直腸表達(dá)部位的區(qū)別在于：尿直腸隔間質(zhì)以及后腸(直腸)上皮層、泄殖腔膜或肛管(瘺管)上皮層表達(dá)減弱，這種改變可能影響了尿直腸隔與泄殖腔膜的融合，從而導(dǎo)致肛門(mén)直腸畸形的發(fā)生。Hoxd-13在大鼠胚胎肛門(mén)直腸的差異表達(dá)，提示Hoxd-13基因可能與肛門(mén)直腸畸形的發(fā)生有關(guān)