巴戟天糖鏈對血管新生中Notch信號通路的作用研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 缺血再灌注損傷(ischemia/rcperfusion injury)是臨床上冠心病人常見的一種嚴重心肌損傷。如何減輕心肌缺血再灌注損傷,恢復心肌供血,保護心肌細胞成為治療冠心病的關鍵。治療性血管新生(therapeutic angiogensis)指通過適當干預,增加功能性血管分支及側支循環(huán)開放,以恢復缺血再灌注損傷后缺血心肌供血,達到改善/治療冠心病目的。近年來,本導師組一直致力于巴戟天糖鏈促進治療

2、性血管新生的作用及機制研究,并證實巴戟天糖鏈可促進雞胚絨毛尿囊血管生成作用、增加MVD的數量:提高乳鼠缺血心肌微血管密度,誘導與血管新生相關的PDGF-β、TRPC6、VEGF、ERK1/2、bFGE等促進血管新生蛋白表達,促進成肌細胞增殖和分化,促進缺氧復氧損傷后內皮細胞遷移和血管管腔樣結構生成等。巴戟天糖鏈促進血管新生的機制較為復雜,因此,本課題將通過觀察巴戟天糖鏈對缺氧復氧損傷后的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)Notch信號轉導通

3、路中Notch1,Jagged1的蛋白表達,探討巴戟天糖鏈在促進血管生成過程中信號轉導的潛在機制并提供理論支持。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)及缺氧復氧損傷模型制備與確定
　　 將HUVEC細胞接種到75ml培養(yǎng)瓶內,給予含10％新生牛血清的RPMI1640高糖培養(yǎng)基,37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取3～7代生長狀態(tài)良好,長滿80%左右的細胞,加入5ml缺氧液并不間斷通入95%N2,5

4、%CO2混合氣體,造成缺氧損傷。1h后將缺氧液吸去,用室溫PBS清洗一遍,加入5ml復氧液并置于3712,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中,造成復氧損傷。2h后將復氧液棄去,加入室溫PBS清洗一遍后,分別加入經過不同處理培養(yǎng)基,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng),24h后顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。
　　 2實驗分組實驗分6組(1)正常細胞組(2)缺氧復氧損傷模型組(3)缺氧復氧損傷模型+麝香保心丸藥液組(陽性藥物對照組)2g/L(4)缺氧復氧損傷模型

5、+MOO小劑量組50mg/L(5)缺氧復氧損傷模型+MOO中劑量組150mg,L(6)缺氧復氧損傷模型+MOO大劑量組450mg/L
　　 3檢測方法(1)采用免疫組化SP法定性檢測Notch通路蛋白表達情況。(2)采用Western-Bloting蛋白印跡法定量測定各組Notch信號轉導通路蛋白表達變化。
　　 4統(tǒng)計學處理結果用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計學分析。計量資料數據用均數士標準差(x±s)表示。檢驗結果均取α

6、=0.05作為檢驗水準。組間比較采用單因素方差分析,當差異有顯著差異時進一步用LSD法進行兩兩比較。
　　 結果：
　　 1、倒置顯微鏡下可見正常HUVEC,胞核圓,胞膜清晰,多邊梭形,鋪路石樣。損傷后細胞收縮變圓,形態(tài)不規(guī)則,細胞間隙變大并出現(xiàn)部分脫落。24h后,各給藥組細胞均出現(xiàn)增殖,以MOO各組呈劑量依賴性的更為顯著。
　　 2、免疫組化SP法檢測結果顯示:Notch信號通路的主要信號分子Notchl和Ja

7、gged均在胞膜和胞漿中表達,除正常組呈弱陽性表達信號外,其余各組均呈陽性表達信號;模型組與正常組相比光密度值顯著升高(p＜0.05);與模型組相比,各用藥劑量組Notchl、Jaggedl光密度值均顯著降低(P＜0.05);MOO3個劑量組之間光密度值均有顯著差異。
　　 3、Western-Bloting蛋白印跡法檢測N0tch1和Jagged1蛋白結果顯示:模型組與正常組相比,蛋白表達量明顯上升(P＜0.05);與模型組相