Notch信號通路對小鼠巨噬細胞功能調控的研究.pdf

1、巨噬細胞是重要的免疫細胞之一。巨噬細胞起源于骨髓造血干細胞，經髓系祖細胞、單核細胞分化而來。巨噬細胞可以通過清除凋亡細胞和產生生長因子的方式參與內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，調控骨的形態(tài)發(fā)生、管腔分支形成、神經網絡和新生血管形成。同時巨噬細胞活化是免疫應答的重要環(huán)節(jié)，可以通過吞噬殺傷作用和產生炎性因子發(fā)揮先天免疫作用，也可以通過抗原呈遞功能啟動T細胞和B細胞介導獲得性免疫應答，其分泌的多種細胞因子對先天免疫和獲得性免疫又具有調節(jié)作用。巨噬細胞功能異

2、常與腫瘤和肥胖等多種疾病密切相關，因而深入研究巨噬細胞發(fā)育和功能的調控，對于進一步闡明穩(wěn)態(tài)維持和免疫應答的發(fā)生機制，以及多種疾病的臨床治療都具有重要的意義。
　　Notch信號通路在進化上高度保守，通過局部細胞間的相互作用以控制細胞命運，是調控胚胎發(fā)育和多種成體組織器官體內穩(wěn)態(tài)和細胞分化的重要信號通路。哺乳動物表達四個Notch受體（Notch1-4）和五個配體（Jagged1、Jagged2、和Delta-like-1、3、4）

3、。細胞表面的Notch受體與配體結合后，在蛋白水解作用下釋放胞內段（NICD）轉位進入細胞核，與轉錄因子RBP-J相互作用，轉而募集轉錄共激活物，活化下游靶基因的轉錄表達。
　　Notch信號通路是調控髓系造血細胞發(fā)育的重要途徑，在造血干細胞的自我更新和髓系細胞的定向分化中都具有重要作用。同時Notch信號通路參與多種免疫細胞功能的調控，包括T細胞、B細胞和DC等。目前的研究提示，Notch信號通路對單核巨噬細胞的發(fā)育和功能具有重

4、要的意義，但研究較少，而且結論不明確。因此，本課題同時應用條件性RBP-J基因剔除小鼠模型和巨噬細胞系RAW264.7穩(wěn)定轉染細胞模型，主要分析了Notch信號通路對巨噬細胞的增殖、抗原呈遞功能和巨噬細胞活化的影響。主要研究結果如下：
　　1.獲得了RBP-J條件性基因剔除小鼠，建立了小鼠巨噬細胞系RAW264.7的穩(wěn)定轉染Notch-1NICD和RBP-J（R218H）的細胞株。
　　通過對RBP-Jflox/wr和Mx-

5、Cre轉基因小鼠的繁育，獲得了足夠數量的的Mx-Cre-RBP-Jflox/wr和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox轉基因小鼠，給予腹腔注射12次polyI:C誘導Cre重組酶的表達后，成功獲得了RBP-J基因剔除小鼠。應用脂質體法轉染小鼠巨噬細胞系RAW264.7，經G418篩選和單克隆化，建立了穩(wěn)定轉染細胞株RAW-NIC和RAW-R218H，經q-PCR檢測Notch通路下游基因HES-1表達水平證實，過表達Notch-1

6、胞內段的RAW-NIC細胞可以有效激活Notch信號通路，而過表達RBP-J顯性負突變蛋白RBP-J(R218H)的RAW-R218H細胞Notch信號通路抑制，成功獲得了Notch信號通路活化和阻斷的巨噬細胞系。RBP-J基因剔除小鼠和穩(wěn)定轉染細胞系的獲得為后續(xù)研究建立了動物模型和細胞模型。
　　2.Notch信號通路阻斷后分化成熟的小鼠腹腔巨噬細胞總數和比例無明顯異常，Notch信號通路體外不影響巨噬細胞系的生長和增殖。

7、>　　分離培養(yǎng)RBP-J剔除小鼠腹腔巨噬細胞，流式細胞術檢測CD11b和F4/80雙陽性細胞總數和比例，與對照小鼠相比，RBP-J剔除后小鼠腹腔巨噬細胞總數和比例都無明顯差別；應用GSI體外阻斷WT小鼠腹腔巨噬細胞的Notch通路后，腹腔巨噬細胞總數和比例也無明顯異常。應用MTT法測定巨噬細胞穩(wěn)定轉染株的生長曲線，同時應用流式細胞術細胞分析周期，各組細胞均無明顯差異。這些結果表明，Notch信號阻斷并不影響小鼠腹腔巨噬細胞分化產生的總數

8、和比例，Notch信號通路的體外活化或抑制并不影響巨噬細胞的生長和增殖。
　　3.Notch信號通路調控小鼠巨噬細胞的抗原呈遞功能，這一作用可能是通過調控共刺激分子CD80和CD86的表達介導的。
　　小鼠腹腔巨噬細胞在RBP-J基因剔除或應用GSI體外阻斷Notch信號通路后，體外與CFSE標記的初始T淋巴細胞共培養(yǎng)，流式細胞術分析表明增殖的T細胞總數和比例顯著低于對照組。進一步研究發(fā)現Notch信號阻斷后腹腔巨噬細胞膜表

9、面共刺激分子CD80和CD86表達顯著減低。而且，巨噬細胞系Notch信號通路活化后，可以促進更多的T細胞增殖。這些結果表明，Notch信號通路可能通過調控小鼠巨噬細胞膜表面共刺激分子CD80和CD86的表達，調控巨噬細胞的抗原呈遞功能。
　　4.Notch信號通路阻斷后，LPS不能誘導小鼠巨噬細胞的經典活化，Notch信號參與調控巨噬細胞對LPS應答中多種炎性細胞因子的產生。
　　Notch信號通路參與LPS誘導的巨噬細胞

10、活化，q-PCR證實LPS活化后，巨噬細胞多個Notch受體和配體的表達改變。RBP-J基因剔除或應用GSI體外阻斷Notch信號通路后，小鼠腹腔巨噬細胞對LPS的應答改變，與對照相比，IL-12產生顯著減少，而IL-10產生輕度增加，不能活化為M1型巨噬細胞，而接近M2巨噬細胞的表型。此外，Notch信號通路可以促進LPS誘導的巨噬細胞產生TNF-α和iNOS，抑制IL-1β的產生，阻斷Notch信號后IL-6的產生增多。這些結果表明

11、，LPS誘導巨噬細胞經典活化過程中依賴Notch通路的作用，Notch信號的缺失導致巨噬細胞M1型活化障礙，而Notch信號通路與LPS共同調控巨噬細胞多種炎性因子的產生。
　　5.Notch信號通路調控巨噬細胞CD11b的表達。
　　通過剔除RBP-J或體外應用GSI阻斷小鼠腹腔巨噬細胞的Notch信號通路，巨噬細胞表達的CD11b在蛋白水平和mRNA水平均顯著減低；活化巨噬細胞系的Notch信號通路可以上調CD11bmR

12、NA水平和蛋白水平的表達。進一步將小鼠CD11b啟動子區(qū)克隆構建基因報告質粒，通過報告基因實驗證實，Notch信號通路對CD11b基因的轉錄無直接調控作用，可能通過間接作用調控CD11b的表達。
　　結論：
　　通過本課題的研究證實，Notch信號通路可以調控巨噬細胞的多種生物學特征。巨噬細胞發(fā)育過程中，Notch信號通路的阻斷不影響小鼠腹腔巨噬細胞分化產生的細胞總數和比例，體外實驗中Notch信號通路不調控巨噬細胞的生長和

13、增殖。然而，Notch信號通路可以調控小鼠巨噬細胞的抗原呈遞功能，這一作用可能是通過調控共刺激分子CD80和CD86的表達介導的。LPS誘導巨噬細胞經典活化過程中依賴Notch通路的作用，Notch信號的缺失導致巨噬細胞M1型活化障礙，而且Notch信號通路與LPS共同調控巨噬細胞多種炎性因子的產生。此外，Notch信號通路還可能通過間接作用調控巨噬細胞膜表面重要標記分子CD11b的表達，這一作用可能成為Notch信號途徑參與調控巨噬細