Notch信號(hào)通路在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及作用機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】
　　缺血再灌注損傷（Ischemia reperfusion injury IRI）是指組織器官缺血后再灌注不僅不能改善組織器官功能恢復(fù)，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。在心肌缺血、腦卒中、創(chuàng)傷等疾病病理過程中都可發(fā)生IRI。肝臟IRI是肝臟外科最常見的病理過程，多見于休克、需要阻斷肝臟血流的肝外科手術(shù)以及肝移植術(shù)等病理生理過程中,研究證實(shí)有10％的早期肝移植失敗都是由于IRI造成，也是引起肝移植術(shù)后急慢性排斥反應(yīng)

2、的重要因素。目前關(guān)于肝臟IRI機(jī)制的研究將該病理過程分為兩個(gè)階段，早期，多為再灌注后6h以內(nèi)，以氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧族（Reactive oxygen species ROS）直接損傷肝細(xì)胞引起肝細(xì)胞凋亡壞死為主要特征；后期，以炎細(xì)胞浸潤(rùn)釋放大量炎癥相關(guān)因子，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，直接或間接引起肝臟細(xì)胞凋亡壞死為特征。
　　經(jīng)典Notch信號(hào)途徑在進(jìn)化上高度保守，研究證實(shí)Notch信號(hào)途徑廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞命運(yùn)決定。

3、在哺乳動(dòng)物，經(jīng)典Notch信號(hào)通路由5種配體（Jagged1,2,and Delta-like[Dll]1,3,and 4）和4種受體（Notch1-4）組成，當(dāng)配體與受體結(jié)合，Notch信號(hào)被激活，在分泌酶（GSI）的酶切作用下，受體胞內(nèi)段?（Notch intracellular domain NICD）被剪切，入核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子RBP-J（recombination signal binding protein J）結(jié)合，啟動(dòng)下

4、游基因如包括Hes家族在內(nèi)的堿性螺旋環(huán)螺旋因子的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)分子事件。近年有報(bào)道證實(shí)，Notch信號(hào)參與了細(xì)胞對(duì)于外界刺激的應(yīng)答，在心、腦缺血性損傷中都有Notch信號(hào)途徑的參與。Notch信號(hào)是否參與肝臟IRI過程？Notch信號(hào)在肝臟IRI中的作用如何？Notch信號(hào)在肝臟IRI中發(fā)揮作用的分子機(jī)制是什么？這些問題的闡明將為IRI相關(guān)的研究開辟新的領(lǐng)域，進(jìn)一步完善肝臟IRI分子調(diào)控理論體系，為肝臟IRI的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)

5、。
　　【目的】
　　研究Notch信號(hào)通路在肝臟IRI中的作用，作用的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，探索肝臟IRI新的分子調(diào)控機(jī)制，為肝臟IRI的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉小鼠肝臟左葉、中葉血供90min，制造小鼠肝臟IRI模型，利用Real-time PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子在肝臟IRI中的表達(dá)變化，利用Western blot檢測(cè)Notch1受體胞內(nèi)段的表達(dá)

6、水平。
　　2.利用PCR方法鑒定小鼠基因型，獲得Mx-Cre-RBP-Jf/f純合子小鼠及Mx-Cre-RBP-Jf/+雜合子對(duì)照小鼠，PolyI-PolyC誘導(dǎo)，在純合子小鼠中剔除RBP-J基因，實(shí)現(xiàn)阻斷Notch信號(hào)。通過檢測(cè)血清ALT、AST水平，組織學(xué)HE染色，TUNEL凋亡染色，MPO免疫組織化學(xué)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，Real-timePCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平，觀察阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI的影響

7、。
　　3.通過分別將RBP-J剔除和對(duì)照小鼠全骨髓細(xì)胞移植給致死劑量照射的野生型小鼠，獲得在骨髓細(xì)胞特異剔除RBP-J小鼠及對(duì)照小鼠，行肝臟IRI造模，通過血清ALT、AST檢測(cè)、組織學(xué)HE染色、TUNEL凋亡染色，觀察骨髓細(xì)胞阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI的影響。
　　4.體外應(yīng)用GSI阻斷Notch信號(hào)，利用肝細(xì)胞體外缺氧（0.5％）培養(yǎng)15h，正常培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)6h，模擬IRI，通過TUNEL凋亡染色，Casepas

8、e 3mRNA水平檢，損傷后剩余活細(xì)胞計(jì)數(shù)，條件培養(yǎng)基刺激巨噬細(xì)胞后Elisa檢測(cè)TNFα水平，觀察肝細(xì)胞阻斷Notch信號(hào)對(duì)IRI的影響。
　　5.利用DCFH-DA探針結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，利用Real-timePCR檢測(cè)iNOS、抗凋亡蛋白Bcl-xlmRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)水平，觀察阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，并利用ROS清除劑觀察ROS在N

9、otch信號(hào)調(diào)控肝臟IRI中的作用。
　　6.利用Real-timePCR檢測(cè)MnSODmRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)MnSOD、磷酸化STAT3、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平，利用免疫共沉淀檢測(cè)Hes5與STAT3蛋白相互作用，通過過表達(dá)持續(xù)激活STAT3觀察STAT3在Notch調(diào)控肝臟IRI中的作用，從而揭示Notch信號(hào)通路調(diào)控肝臟IRI中肝細(xì)胞ROS的分子機(jī)制。
　　7.通過將肝細(xì)胞與過表達(dá)Notch配

10、體Dll1OP-9細(xì)胞共培養(yǎng)或過表達(dá)Hes5激活Notch信號(hào)，觀察激活Notch信號(hào)對(duì)肝細(xì)胞IRI的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.在肝臟IRI中伴隨著Notch信號(hào)途徑的廣泛激活及下游分子的表達(dá)上調(diào)：在肝臟IRI中，Notch1、Notch2、Dll4、Jagged2、Hes5mRNA表達(dá)上調(diào)、NICD蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.阻斷Notch信號(hào)會(huì)導(dǎo)致肝臟IRI加重。表現(xiàn)為：血清ALT、AST水平升高；肝細(xì)胞凋亡、

11、壞死增加；中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，炎癥因子TNFα、IL1β、IL6、IFNγ，趨化因子CCL3，粘附分子ICAM1產(chǎn)生增加。
　　3.阻斷Notch信號(hào)引起肝臟IRI中肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，并且，應(yīng)用ROS清除劑可以挽救Notch信號(hào)阻斷引起的血清ALT、AST升高，肝細(xì)胞凋亡壞死增加，說明Notch信號(hào)阻斷引起肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，最終導(dǎo)致IRI加重。
　　4.進(jìn)一步分子機(jī)制的研究證實(shí)：阻斷Notc

12、h信號(hào)導(dǎo)致下游分子Hes5表達(dá)下調(diào)使得Hes5-STAT3復(fù)合物形成障礙，導(dǎo)致STAT3磷酸化水平下降，引起MnSOD表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，過表達(dá)持續(xù)激活STAT3可以上調(diào)MnSOD表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，挽救IRI中Notch信號(hào)阻斷引起的細(xì)胞凋亡增加。
　　5.體外配體激活Notch或過表達(dá)Hes5對(duì)肝細(xì)胞IRI起到保護(hù)性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，細(xì)胞凋亡減少。我們的研究結(jié)果說明，經(jīng)典Notch信

13、號(hào)途徑通過其下游分子Hes5協(xié)助STAT3的激活，進(jìn)而引起MnSOD表達(dá)上調(diào)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，在IRI中對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)性作用。
　　【結(jié)論】
　　1.Notch信號(hào)通路在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用，Notch信號(hào)缺失會(huì)引起肝臟IRI加重。
　　2.肝細(xì)胞是Notch信號(hào)調(diào)控肝臟IRI的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，在骨髓細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)對(duì)肝臟IRI無(wú)明顯影響，肝細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)引起IRI肝細(xì)胞凋亡增加。

14、　　3.Notch信號(hào)通過調(diào)控肝臟IRI中肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響肝臟IRI，Notch信號(hào)缺失引起肝臟IRI中肝細(xì)胞ROS水平升高。
　　4.Notch信號(hào)通過其下游分子Hes5影響STAT3的激活，進(jìn)而調(diào)控MnSOD的表達(dá)，最終影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Notch信號(hào)缺失引起Hes5-STAT3復(fù)合物水平下降，MnSOD表達(dá)下調(diào)，ROS清除減少。
　　5.體外激活肝細(xì)胞Notch信號(hào)對(duì)IRI起到保護(hù)性作用，激活肝細(xì)胞Notch