Notch信號通路對小鼠小膠質(zhì)細胞功能的調(diào)控作用.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病是威脅人類健康的殺手之一，其患病率隨著社會老齡化的進程而日漸升高。帕金森?。≒arkinson’sdisease，PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病。在發(fā)達國家，60歲以上人群中該病的患病率約為1％。但是對神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病原因和機理還知之甚少，目前普遍認為由小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥是這類疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，適當干預小膠質(zhì)細胞的活化有可能延緩PD等神經(jīng)退行性疾病的病程進展。小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)炎癥反應過程中表現(xiàn)為不同的

2、極化表型：M1型小膠質(zhì)細胞促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用；M2型小膠質(zhì)細胞則抑制神經(jīng)炎癥的進展，對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。
　　Notch信號通路是與小膠質(zhì)細胞活化相關的重要信號通路之一。該通路在進化上高度保守，通過局部細胞間相互作用決定細胞命運，是調(diào)控胚胎發(fā)育和多種成體組織器官體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞分化的重要信號通路。Notch信號通路參與多種免疫細胞的功能調(diào)控，如Notch通路參與調(diào)控小鼠外周巨噬細胞的抗原呈遞功能、活化功能；N

3、otch通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞對不同刺激的活化反應。
　　目前僅利用原代小膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞系MMGT12對小膠質(zhì)細胞在不同刺激下的極化反應，及Notch通路對該反應的調(diào)控作用進行了初步研究；但是這種極化反應及Notch通路對該反應的調(diào)控作用在其他小膠質(zhì)細胞系是否具有可重復性，小膠質(zhì)細胞的極化表型是否會隨微環(huán)境的改變而改變，以及Notch通路對小膠質(zhì)細胞極化反應的調(diào)控是否可以持續(xù)存在，目前尚不清楚。
　　小膠質(zhì)細胞系N9是

4、小鼠來源的永生化小膠質(zhì)細胞，易培養(yǎng)，被廣泛用于小膠質(zhì)細胞的功能研究。
　　目的：
　　(1)N9小膠質(zhì)細胞是否具有極化現(xiàn)象，這種極化表型是否會隨微環(huán)境的改變而變化；
　　(2)N9小膠質(zhì)細胞是否表達Notch通路相關分子；
　　(3)Notch信號通路是否影響N9細胞的體外增殖；
　　(4)Notch信號通路是否參與調(diào)控N9細胞的M1/M2型極化，這種調(diào)控效應是否具有可持續(xù)性。
　　通過研究本課題，以

5、期為神經(jīng)退行性疾病的防治提供新的診療策略。方法：
　　(1)單獨應用脂多糖（LPS）或白介素4（IL-4），及聯(lián)合序貫應用LPS和IL-4刺激N9細胞；采用ELISA檢測白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌量、Griessreagent檢測亞硝酸鹽的含量、實時定量PCR（q-PCR）法檢測N9細胞中各型極化標志分子的表達水平。
　　(2)采用q-PCR法檢測N9細胞中Notch通路相關分子的表達水平。

6、r>　　(3)將N9細胞分為空白對照組、二甲基亞楓（DMSO）孵育組和γ-分泌酶抑制劑（GSI）孵育組；采用MTT法測定N9細胞的生長曲線。
　　(4)使用GSI持續(xù)孵育，或孵育特定時間后停止一段時間，再分別用LPS/IL4刺激N9細胞；采用ELISA檢測IL-6和TNF-α的分泌量、Griessreagent檢測亞硝酸鹽的含量、q-PCR法檢測N9細胞中各型極化標志分子的表達水平。
　　結果：
　　(1)LPS刺激組

7、M1型標志分子IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）表達上調(diào)，IL-4刺激組M2型標志分子Arg、Ym1、CCR2及Mmr表達上調(diào)；當N9細胞先被LPS刺激、中途撤掉LPS后再被IL4刺激時，IL-6、TNF-α和NO依然高表達，而Ym1和CCR2則表達受抑制；反之，先用IL4刺激后換成LPS刺激時，仍然表現(xiàn)為N9細胞高表達IL-6、TNF-α和NO，而對Ym1和CCR2表達抑制。
　　(2)N9細

8、胞表達Notch受體（Notch1），配體（Jagged2、Dll-1、Dll-4）及下游分子（Hes1、Hes5）。
　　(3)GSI處理組與對照組相比，N9細胞的增殖能力無明顯變化。
　　(4)與對照組相比，GSI處理組中IL-6、TNF-α、NO及iNOS的表達顯著下降，Arg、Ym1、CCR2及Mmr的表達明顯上調(diào)；撤銷GSI后，TNF-α、IL-6及NO的表達仍低于對照組，而Arg和Ym1的表達仍高于對照組。結論：