Notch信號(hào)通路在宮頸癌發(fā)病中的作用研究.pdf

1、目的：子宮頸癌是全球婦女發(fā)病率僅低于乳腺癌的第二個(gè)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。宮頸癌的致病因素比較明確，人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）感染已被確定是高危因素，尤以HPV16和18型最常見(jiàn)。HPVE6、E7癌基因整合到宿主細(xì)胞后，分別與p53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致這兩種抑癌基因失活，改變了細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控機(jī)制，引起宿主細(xì)胞永生化，最終引起宮頸癌。
　　研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在維持細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間的平

2、衡起著至關(guān)重要的作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。數(shù)十年前在宮頸癌的相關(guān)研究中檢測(cè)到Notch1，提示其在宮頸癌中可能發(fā)揮作用。從宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤(rùn)癌的過(guò)程中，Notch受體及其配體Jagged1蛋白水平升高。Notch1協(xié)同HPVE6和E7癌基因促進(jìn)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞惡變。但是也有研究表明Notch1在宮頸癌中具有抑癌作用，其雙重作用可能與Notch1濃度和宮頸病變不同階段有關(guān)。Notch信號(hào)激活對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitheli

3、almesenchymaltransition,EMT）的啟動(dòng)至關(guān)重要，EMT發(fā)生過(guò)程中上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)形態(tài)變化，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，降低細(xì)胞間的黏附能力和增加其運(yùn)動(dòng)能力，使細(xì)胞遷移能力增加，抑制細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)侵襲能力，與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。此外，Notch信號(hào)與其他信號(hào)，如Wnt/β-catenin、TGF-β、PI3K/Akt通路存在交互作用，通過(guò)不同機(jī)制對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　本研究將了解Notch信號(hào)通路在

4、宮頸癌病變過(guò)程中可能發(fā)揮的作用，以及與HPV的相關(guān)性，旨在探討Notch信號(hào)通路與HPV感染在宮頸病變進(jìn)展中潛在的作用機(jī)制，并欲求尋找能阻斷抑制宿主細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子，為探索宮頸癌防治新策略和新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型。體外培養(yǎng)HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌細(xì)胞SiHa。擴(kuò)增并提取小干擾RNA（miRNA）質(zhì)粒，包括HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA干擾質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)

5、照Neg-miRNA空白質(zhì)粒。將SiHa細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠右前腋窩中部外側(cè)皮下，待腫瘤體積約為80~120mm3，根據(jù)成瘤情況32只裸鼠隨機(jī)分為4組，包括2個(gè)對(duì)照組，即生理鹽水組（簡(jiǎn)稱鹽水對(duì)照組）和空質(zhì)粒組（Neg-miRNA組），2個(gè)治療組，即HPV16E6基因沉默組（HPV16E6-miRNA組）和HPV16E7基因沉默組（HPV16E7-miRNA組）。利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式，定期定量對(duì)4組裸鼠分別行瘤內(nèi)多點(diǎn)注射生理鹽水、Neg

6、-miRNA、HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA，每隔2天注射一次，共注射9次，每次注射前測(cè)量腫瘤體積，腫瘤生長(zhǎng)情況，最后一次給藥48小時(shí)后處死裸鼠，及時(shí)移植瘤取材，測(cè)量移植瘤體積徑和重量，分裝標(biāo)本。
　　2、取材后提取RNA，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)方法檢測(cè)SiHa細(xì)胞宮頸癌裸鼠移植瘤中目的基因的mRNA水平，包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。
　　3、收

7、集2014年3月至2015年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院因?qū)m頸病變行陰道鏡活檢或手術(shù)的宮頸組織，及時(shí)放入4％多聚甲醛固定，后放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ渲袑m頸病變包括低度宮頸上皮內(nèi)瘤變（LSIL）16例和高度宮頸上皮內(nèi)瘤變（HSIL）27例，術(shù)前未進(jìn)行放化療的宮頸癌組織共21例，其中包括鱗狀細(xì)胞癌18例、腺癌3例，術(shù)前行新輔助化療的宮頸鱗癌5例、宮頸腺癌2例以及宮頸腺鱗癌1例，根據(jù)2009年FIGO分期包括IA期6例，IB期13例，IIA1

8、0例，同時(shí)期收集因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的宮頸標(biāo)本共10例作為對(duì)照組。所有病例均采用羅氏Cobas4800HPV檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)14種高危型HPVDNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，包括HPV16、18和其余12種亞型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68）。對(duì)照組術(shù)前TCT檢查除外宮頸病變，HPV檢測(cè)結(jié)果為陰性，術(shù)后病理顯示宮頸無(wú)異常。收集所有手術(shù)病人的基本信息、HPV結(jié)果和完整的病理結(jié)果。所取

9、宮頸組織經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)及患者和/或家屬知情同意。
　　4、人體宮頸組織標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)目的基因的蛋白表達(dá)情況，包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。分析Notch信號(hào)通路對(duì)EMT和宮頸癌發(fā)病過(guò)程的影響。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立裸鼠皮下移植瘤
　　1.1裸鼠全部存活，成瘤潛伏期約為30天，肉眼可見(jiàn)明顯移植瘤，體積約80~120mm3，外形不規(guī)則，個(gè)別

10、瘤體可出現(xiàn)潰破和出血，剝離瘤塊見(jiàn)瘤體質(zhì)硬，切面灰白色壞死灶，未見(jiàn)明顯血管生成，成瘤率為100%。1.2通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式分別沉默HPV16E6和E7基因，兩個(gè)治療組裸鼠移植瘤在小鼠被處死前的體積和腫瘤重量均小于兩個(gè)對(duì)照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.3各組宮頸癌裸鼠移植瘤Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB的mRNA水平
　　采用Real-TimePCR分別檢測(cè)4組移植瘤中目的基因的mR

11、NA的表達(dá)水平。HPV16E6基因沉默組和HPV16E7基因沉默組分別與空質(zhì)粒組和鹽水對(duì)照組比較，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κBmRNA表達(dá)水平均降低，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？召|(zhì)粒組與鹽水對(duì)照組比較，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κBmRNA的表達(dá)水平無(wú)差異，P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明SiHa細(xì)胞宮頸癌移植瘤中的HPV16E6/E7基因沉默后，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

12、途徑受抑制。
　　2、人體宮頸組織標(biāo)本分析
　　2.1高危型HPV（high-oncogenicriskHPV,hr-HPV）感染率
　　hr-HPV感染檢出率隨著宮頸病變的進(jìn)展升高。正常對(duì)照組無(wú)hr-HPV感染；LSIL組織中hr-HPV陽(yáng)性率1.25%（2/16）；HSIL組織中hr-HPV陽(yáng)性率88.89%（24/27）；宮頸癌組織中hr-HPV陽(yáng)性率100%（29/29）。hr-HPV感染率以HPV16陽(yáng)性為主

13、（45/55），其次為HPV18陽(yáng)性（4/55）。2.2Notch信號(hào)通路Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB蛋白的表達(dá)
　　在正常宮頸上皮和LSIL組織中，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)均較弱；而HSIL組中，上述5種目的蛋白表達(dá)為陽(yáng)性；宮頸癌組織中，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。Notch信號(hào)通路中Notch1、J

14、agged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá)在宮頸病變進(jìn)展過(guò)程中逐漸增多，LSIL上述5種目的基因的蛋白表達(dá)與宮頸癌比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　術(shù)前進(jìn)行新輔助化療的宮頸鱗癌組織中上述蛋白表達(dá)較未行化療的宮頸鱗癌組織明顯減少，5種目的基因的蛋白表達(dá)比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而宮頸腺癌組織術(shù)前化療與未化療比較，上述蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但因樣本例數(shù)?。?例），無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。認(rèn)為術(shù)前行新輔助化

15、療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá)，而對(duì)宮頸腺癌組織中目的蛋白表可能無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立了SiHa細(xì)胞宮頸鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型，并利用RNA干擾技術(shù)證明HPV16E6-miRNA和HPV16E7-miRNA能夠有效抑制移植瘤生長(zhǎng)，RNA干擾技術(shù)可用于宮頸癌的體內(nèi)研究；
　　2、沉默HPV16E6/E7基因抑制小鼠移植

16、瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)，可能通過(guò)下調(diào)Notch信號(hào)通路的主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB而發(fā)揮作用；
　　3、Notch信號(hào)通路中主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá)隨宮頸病變進(jìn)展而逐漸增多，Notch信號(hào)通路參與宮頸癌發(fā)生；
　　4、術(shù)前行新輔助化療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋