家蠶來(lái)源腸球菌的RAPD分型及類腸球菌素的分離純化.pdf

1、腸球菌是家蠶消化道中的一種正常菌群。它直接參與了宿主的多種生理代謝活動(dòng)，是宿主正常生理活動(dòng)不可缺少的重要組成部分。 同時(shí)腸球菌也是一種潛在性致病菌，健康家蠶對(duì)其具有足夠的預(yù)防能力，只有在宿主體質(zhì)虛弱或環(huán)境不良的情況下才會(huì)發(fā)揮致病作用，是引起家蠶細(xì)菌性腸道病的病原細(xì)菌，因此探討該菌叢的生物學(xué)特性及生態(tài)變化，對(duì)了解家蠶細(xì)菌性腸道病致病機(jī)理和腸球菌與其它病原微生物互作等方面都具有重要意義。 傳統(tǒng)的數(shù)值分類學(xué)的鑒定方法，工作量大

2、、時(shí)間長(zhǎng)。隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)是分子生物學(xué)中重要的研究手段之一。它能在DNA水平反映不同樣本之間的差別。本試驗(yàn)通過優(yōu)化Mg2+濃度、DNA模板加入量、引物濃度、TaqDNA聚合酶加入量、PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等建立了家蠶來(lái)源腸球菌的RAPD-PCR反應(yīng)體系，并對(duì)從家蠶消化道中分離的表現(xiàn)為生理生化特性多樣性的14個(gè)腸球菌分離菌株和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了DNA多態(tài)性研究。確定了家蠶來(lái)源腸球菌RAPD分析的反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)總體積

3、25μL，反應(yīng)液中含模板DNA為50ng；Mg2+3.5mmol/L；dNTPs200mmol/L；TaqDNA聚合酶3U；引物濃度15pmol/L；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，35℃退火40s，72℃延伸1min，45次循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，然后4℃保存。應(yīng)用篩選的8條隨機(jī)引物，共擴(kuò)增出625個(gè)位點(diǎn)，其中99.7％為多態(tài)性位點(diǎn)，表明供試菌株具有豐富的DNA多態(tài)性。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，

4、供試菌株分為Entfaecium、Ent.casseliflavus、Ent.avium、Entfaecalis4個(gè)類群。本試驗(yàn)RAPD分型結(jié)果與前期數(shù)值鑒定結(jié)果基本一致。 本研究室前期研究結(jié)果表明，家蠶來(lái)源腸球菌外分泌蛋白具有抑制N.b發(fā)芽的作用。本試驗(yàn)以家蠶來(lái)源腸球菌(EntfaecalisZJU)和家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis，簡(jiǎn)稱N.b)為材料，篩選了一種適合EfZJU生長(zhǎng)和外分泌蛋白含量高的培養(yǎng)基，并對(duì)抑

5、制微孢子蟲發(fā)芽的菌外分泌蛋白進(jìn)行了初步的分離純化，以期為利用腸球菌開展蠶病的微生態(tài)防治提供參考。 培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)表明，進(jìn)口MRS(-G)培養(yǎng)基所得透析液的底色較淺，對(duì)用分光光度法測(cè)定微孢子蟲的發(fā)芽抑制率影響最小。吐溫添加量控制在5-10g/L，在37℃150r/min條件下培養(yǎng)30h時(shí)EfZJU的生長(zhǎng)情況最好，細(xì)菌繁殖達(dá)到最高峰，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中養(yǎng)分逐漸消耗，細(xì)菌處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線后期，細(xì)菌數(shù)目逐漸減少。用Bra

6、dford法測(cè)得其蛋白含量最大可達(dá)3.32mg/mL，對(duì)家蠶微孢子的發(fā)芽抑制率在72.0％。 蛋白分離純化試驗(yàn)結(jié)果表明，將蛋白粗提液過SephadexG-75柱，收集其3個(gè)吸收峰，用PEG包埋法濃縮后進(jìn)行微孢子蟲發(fā)芽抑制試驗(yàn)。結(jié)果峰Ⅰ、Ⅱ?qū)ξ㈡咦拥陌l(fā)芽相對(duì)抑制率在20.5％，峰Ⅲ的相對(duì)抑制率在59.0％,說(shuō)明活性物質(zhì)主要存在于峰Ⅲ中。 SDS-PAGE電泳結(jié)果表明峰Ⅰ、Ⅱ沒有蛋白條帶，峰Ⅲ有三條主要的蛋白帶，分子量在50