腸球菌中α-L-鼠李糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、α-L-鼠李糖苷酶是一種水解酶，可以水解人們?nèi)粘ｏ嬍持谐Ｒ?jiàn)的黃酮苷類(lèi)化合物，廣泛分布于自然界的細(xì)菌和真菌中。Α-L-鼠李糖苷酶在實(shí)際工藝中具有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值。本論文選用Enterococcus durans作為發(fā)酵菌種，對(duì)α-L-鼠李糖苷酶的活性條件測(cè)定進(jìn)行了研究，重點(diǎn)討論了從發(fā)酵液中分離提純得到α-L-鼠李糖苷酶的主要過(guò)程，并研究了純化后的α-L-鼠李糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)確定了α-L-鼠李糖苷

2、酶的活性測(cè)定條件：在10 mL的比色管中，加入2 mL pH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液后，再加入0.1 mL酶液或粗酶液，置于45 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，加入0.2mL已經(jīng)預(yù)熱的對(duì)硝基苯基-α-L-鼠李糖苷作為底物，反應(yīng)4 min，反映結(jié)束后立即取出并加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，冷卻至室溫后，于400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。
　　 (2)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交試驗(yàn)對(duì)Enterococcus d

3、urans 產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳配比為：蔗糖1.25％，大豆蛋白胨1.25％，磷酸二氫鉀2 mmol/L，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，硫酸鐵3 mmol/L；相應(yīng)的產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基的初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度為34℃，發(fā)酵周期為4 d，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,250 mL三角瓶裝液量為70 mL，接種量為3％。
　　 (3)α-L-鼠李糖苷酶的分離純化：<

4、br>　　 ① 實(shí)驗(yàn)確定了硫酸銨分級(jí)沉淀濃度范圍為50～80％；
　　 ② 硫酸銨鹽析后的沉淀用20 mL 4℃蒸餾水溶解后，裝入透析袋，置于4℃蒸餾水中透析約30h后，濃縮至5mL；
　　 ③ 采用DEAE-纖維素52陰離子交換層析純化α-L-鼠李糖苷酶：采用平衡緩沖液的pH為5.0，KCl梯度線性化洗脫濃度為0.2～0.6 mol/L，在KCl濃度低于0.2 mol/L或高于0.6 mol/L時(shí)，基本沒(méi)有蛋白峰洗出

5、。洗脫流速為0.6 mL/min，15 min收集一管，發(fā)現(xiàn)收集的第12管中酶活最高，第一蛋白峰沒(méi)有目的酶活性，為雜蛋白峰，KCl濃度為0.3～0.5 mol/L時(shí)，即可把α-L-鼠李糖苷酶洗脫下來(lái)。
　　 ④ 采用SephadeXG-100 凝膠過(guò)濾層析純化α-L-鼠李糖苷酶：用pH5.0、濃度0.02 mol/L的醋酸緩沖液洗脫，流速為0.4 mL/min，15 min收集一管，得到三個(gè)蛋白峰，第三個(gè)為峰為目標(biāo)峰。
　

6、　 (4)對(duì)鹽析后和凝膠層析純化后的酶蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10％，濃縮膠濃度為6％。結(jié)果表明，鹽析并透析后的酶液仍含有很多雜蛋白，經(jīng)過(guò)離子交換層析和凝膠層析后，SDA-PAGE凝膠電泳顯示單條帶，表明酶蛋白已經(jīng)得到純化，并確定酶蛋白的分子量約為90 Kda。
　　 (5)純化后的α-L-鼠李糖苷酶經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)耐酸性較強(qiáng)并具有較強(qiáng)的耐熱性；K+、Mg2+對(duì)α-L-鼠李糖苷酶具有明顯的激活作用，而