繡球菌多糖提取、分離純化及生物活性研究.pdf

1、繡球菌（sparassis crispa）具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)人體新陳代謝、降低血壓血脂、提高造血及免疫調(diào)節(jié)等食用和藥用的功能。富含多糖、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及多種維生素，其中多糖成分是繡球菌諸多生理功能的活性成分代表，尤其以β-葡聚糖含量最為顯著，可達(dá)50％-60%。因此，提取繡球菌多糖具有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。當(dāng)前我國(guó)正在擴(kuò)大繡球菌的栽培以及深加工的步伐，然而對(duì)其多糖的提取、產(chǎn)品開發(fā)、臨床應(yīng)用等仍為空白。本課題主要

2、是采用復(fù)合酶對(duì)繡球菌多糖成分進(jìn)行有效的提取；對(duì)多糖的脫蛋白工藝進(jìn)行研究；探究繡球菌多糖的體外抗氧化活性以及結(jié)構(gòu)鑒定等。以期為其系列產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。本文具體內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　復(fù)合使用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等對(duì)繡球菌多糖進(jìn)行提取，采用正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶最佳配比，進(jìn)一步采用響應(yīng)面法對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)繡球菌粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，采用幾種脫蛋白的方法進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選出一種蛋白脫除率高以及多糖損失率小的方法進(jìn)行工

3、藝優(yōu)化；對(duì)提取出的多糖通過脫除蛋白成分；透析處理；柱層析等進(jìn)行分離、純化，得出均一的兩個(gè)多糖組分SC1-1、SC2-1；對(duì)經(jīng)過純化的多糖組分、脫除蛋白后的組分、粗多糖成分等通過試驗(yàn)研究其體外抗氧化效果；用紅外光譜法和核磁共振法對(duì)此多糖組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
　　（1）復(fù)合酶法提取繡球菌多糖
　　酶復(fù)合使用提取繡球菌多糖的工藝得出，添加比例為木瓜蛋白酶0.6%、果膠酶0.4%、纖維素酶0.6%；最佳提取工藝為酶解時(shí)pH值4.16、

4、時(shí)間為3.41 h、溫度為53.73℃、料液比1：15.63。在此提取條件下多糖得率達(dá)到14.3%。
　?。?）粗多糖溶液脫蛋白工藝研究
　　從蛋白脫除率和多糖保留率綜合評(píng)價(jià)，采用酶法、CaCl2法、HCl法、三氯乙酸(TCA)法及sevage法等對(duì)繡球菌多糖溶液進(jìn)行脫除蛋白處理，試驗(yàn)結(jié)果為：TCA法對(duì)于繡球菌多糖溶液的蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率較其他方法有一定的優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明在 TCA濃度為15%，添

5、加量為30%，振蕩時(shí)間15 min，靜置25 min。蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率分別為：90.64%，80.59%。
　?。?）體外抗氧化活性研究
　　使用試劑盒，分別測(cè)定繡球菌多糖的總抗氧化能力、清除O2-·、·OH-和DPPH的能力，從而研究繡球菌多糖的體外抗氧化性活性。試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)分離純化的單一組分SC1-1、SC2-1、已脫除蛋白的溶液及繡球菌粗多糖溶液均在不同程度上的具備了總抗氧化的能力、清除O2-·、·OH-和D

6、PPH的能力。純化后的多糖組分SC1-1，SC2-1清除能力都不及未分離純化的SC或SC1，因此說明多糖在對(duì)羥自由基的清除各組分之間具有協(xié)同作用。脫除蛋白的溶液及各純化后的多糖組分對(duì)超氧陰離子的抑制能力顯著高于粗多糖溶液(P<0.05)。純化后的多糖組分酸性組分的多糖的總抗氧化能力比中性組分的多糖強(qiáng)(P<0.05)。在濃度為5 mg/mL時(shí)，已脫蛋白溶液在DPPH的清除能力上達(dá)到96.25%。這些體外抗氧化能力均與多糖溶液的濃度呈現(xiàn)顯著

7、的劑量效應(yīng)。
　?。?）多糖組分結(jié)構(gòu)鑒定
　　紅外光譜分析結(jié)果顯示SC1-1、SC2-1多糖組分的分子中均含有-OH、-COO-、C-O-C、C=C、-CH3、-CH2、-CH等官能團(tuán)。且為雜聚多糖，同時(shí)含有α-型和β-型糖苷鍵，其中以β型吡喃糖為主。核磁共振圖譜顯示糖鏈同時(shí)有（1→3）、（1→6）取代。推斷多糖生物活性中起主要作用的應(yīng)該是碳鏈中以（1→6）相連的β（1→6）D-吡喃型葡萄糖。SC1-1、SC2-1在結(jié)構(gòu)上較