萬古霉素耐藥腸球菌的分子特征及腸球菌感染小鼠代謝組學(xué)分析.pdf

1、目的：對實驗室保存的325株腸球菌進(jìn)行萬古霉素非敏感菌篩選，并對篩選出的菌株進(jìn)行耐藥表型、耐藥基因型、菌株同源性分析;建立糞腸球菌ATCC29212和ATCC51299感染Balb/c小鼠膿毒癥模型;建立基于液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)非靶向與靶向代謝組學(xué)相結(jié)合的分析方法，開展腸球菌感染小鼠膿毒癥代謝組學(xué)分析，尋找疾病狀態(tài)下生物標(biāo)志物，分析小鼠感染過程中可能影響的代謝通路。
　　方法：采用瓊脂平皿二倍稀釋法或肉湯微稀釋法篩選萬古霉素非敏感菌，

2、并檢測菌株對替考拉寧的敏感性;采用PCR方法檢測萬古霉素非敏感腸球菌的耐藥基因型;通過腸道細(xì)菌基因間重復(fù)一致序列(ERIC) PCR技術(shù)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)、多位點序列分型(MLST)技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析。建立糞腸球菌ATCC29212和ATCC51299腹腔感染小鼠膿毒癥模型，通過血培養(yǎng)確證模型的成功，在小鼠感染前后進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，監(jiān)測小

3、鼠膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中狀態(tài)的變化。建立基于液相質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)的血漿非靶向代謝組學(xué)分析方法，應(yīng)用于糞腸球菌ATCC29212感染小鼠后4h、8h、24 h的血漿樣本分析，建立多元統(tǒng)計模型，通過S-plot圖，VIP list，Jack-knifed置信區(qū)間圖，獨立樣本t-test篩選差異性代謝物，對得到的差異性代謝物進(jìn)行代謝物富集分析和代謝途徑分析，獲取小鼠膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中可能相關(guān)的代謝通路。以非靶向代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)的差異性代謝物

4、和文獻(xiàn)中報導(dǎo)的部分生物標(biāo)志物為對象，建立基于LC-MS/MS技術(shù)的靶向代謝組學(xué)分析方法，對方法的精密度和靈敏度進(jìn)行考察，并應(yīng)用于腸球菌ATCC29212和ATCC51299感染小鼠靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)合獨立樣本t檢驗，篩選潛在生物標(biāo)志物。
　　結(jié)果：從325株臨床分離腸球菌中共篩選出17株萬古霉素非敏感菌，包括1株糞腸球菌、11株屎腸球菌和5株鶉雞腸球菌。其中1株糞腸球菌和11株屎腸球菌對萬古霉素高水平耐藥，對替考拉寧耐藥或中介耐

5、藥，PCR檢測結(jié)果顯示vanA型;5株鶉雞腸球菌對萬古霉素中介耐藥，對替考拉寧敏感，PCR檢測結(jié)果顯示vanC1型。ERIC同源性分析顯示同基因型的大多數(shù)菌株顯示相似的ERIC分型;PFGE同源性分析顯示，17株臨床萬古霉素非敏感腸球菌分型不同，不屬于單克隆流行播散;MLST同源性分析顯示，1株臨床萬古霉素非敏感糞腸球菌屬于ST4，11株臨床萬古霉素非敏感屎腸球菌共分為6個ST型，其中4株屬于ST78，是屎腸球菌出現(xiàn)頻率最高的ST型。在

6、腸球菌感染小鼠非靶向代謝組學(xué)分析中，成功建立了腸球菌感染小鼠膿毒癥模型，采用基于LC-MS技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)分析，對空白對照組與感染后4h、8h、24 h組小鼠進(jìn)行兩兩比對分析，在ESI正離子檢測模式下分別得到了69種、69種、61種差異性代謝物，在負(fù)離子檢測模式下分別得到了99種、91種、90種差異性代謝物，綜合兩兩比對結(jié)果，最終得到了95種差異性代謝物，其中21種差異性代謝物在整個感染過程中均有顯著的變化。代謝物富集分析和代謝通路

7、分析結(jié)果推測膿毒癥影響氨基酸代謝、磷脂代謝、三羧酸循環(huán)、亞油酸和亞麻酸代謝、尿素循環(huán)。以40種差異性代謝物為對象，建立靶向代謝組學(xué)分析方法，針對糞腸球菌ATCC29212和ATCC51299感染小鼠膿毒癥模型進(jìn)行分析，最終在糞腸球菌ATCC29212感染小鼠膿毒癥模型中篩選出17種潛在生物標(biāo)志物，在糞腸球菌ATCC51299感染小鼠膿毒癥模型中篩選出12種潛在生物標(biāo)志物。
　　結(jié)論：我國萬古霉素耐藥菌在糞腸球菌中分離率較低，但屎腸

8、球菌中萬古霉素耐藥情況較嚴(yán)重，并且耐藥菌株攜帶易于傳播和轉(zhuǎn)移的vanA基因。同源性分析結(jié)果顯示萬古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性;在糞腸球菌ATCC29212感染小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)的17種潛在生物標(biāo)志物中，感染動物體內(nèi)?；撬?、胸苷、胞苷、肌酸、谷氨酰胺、2-甲基蘋果酸、核黃素、檸檬酸8種代謝物含量上升，而PE(P-16∶0/0∶0)、肌苷、可的松、馬尿酸、吲哚、色氨酸、龍膽酸、蛋氨酸、丙酮酸9種代謝物含量下降;在糞腸球菌ATCC512