臨床分離腸球菌耐藥性、毒力基因及多位點序列分型研究.pdf

1、第一部分臨床分離腸球菌耐藥性分析研究
　　 目的：了解臨床分離腸球菌耐藥特征,給臨床診斷和治療腸球菌感染提供依據(jù),為進一步開展腸球菌耐藥機理和分型研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.菌株來源:397例腸球菌全部分離自杭州市中醫(yī)院2005年2月至2008年3月期間的住院患者,其中糞腸球菌339株,屎腸球菌58株。
　　 2.藥敏實驗:所有菌株均經(jīng)生物梅里埃公司API鑒定板條鑒定。應(yīng)用法國生物梅里埃公

2、司VITEK2全自動細(xì)菌分析儀配套試劑進行藥物敏感試驗。以糞腸球菌ATCC29212為質(zhì)控菌。
　　 研究結(jié)果：
　　 藥敏試驗表明,腸球菌已成為醫(yī)院感染重要的耐藥菌,397株腸球菌屬臨床分離株中,糞腸球菌和屎腸球菌對11種抗菌藥物具有不同的耐藥譜。除對萬古霉素外,兩種腸球菌耐藥情況較為嚴(yán)重,屎腸球菌對氯霉素、氨芐西林、四環(huán)素的敏感率為89.66％、46.55％、39.66％,而糞腸球菌為73.82％、46.31％、39

3、.35％。對萬古霉素耐藥率較低,分別為7.72％、7.94％。從MIC的分布情況來看,90％糞腸球菌和91％屎腸球菌對萬古霉素的MIC≤4μg/ml。
　　 結(jié)論：
　　 屎腸球菌和糞腸球菌耐藥情況較為嚴(yán)重,屎腸球菌對氯霉素、氨芐西林、四環(huán)素的敏感率較高,而糞腸球菌敏感率較低.屎腸球菌和糞腸球菌對萬古霉素耐藥率均較低。
　　 第二部分臨床分離腸球菌毒力基因及多位點序列分型研究研究
　　 目的：比較杭州地區(qū)

4、萬古霉素敏感屎腸球(vancomycin susceptible Enterococcus faecium,VSEF)和萬古霉素耐藥屎腸球菌(vancomyeinresistant Enterococcusfaecium,VREF)分離菌株的遺傳背景、耐藥機理和分子分型。
　　 研究方法：
　　 1.菌株來源：收集2008年5月至2009年8月期間臨床分離萬古霉素耐藥屎腸球菌(VREF)19株,來自杭州地區(qū)三家醫(yī)院;收集

5、2008年10月至2009年10月期間浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床分離萬古霉素敏感屎腸球菌(VSEF)21株,作為對照菌株。以類腸球菌ATCC29212為質(zhì)控菌。
　　 2.藥敏實驗：按照NCCLS推薦的K-B法或E-test法檢測21株VSEF和19株VREF對利奈唑胺(LZD)、萬古霉素(VAN)、替考拉寧(TEC)、奎奴普丁/達福普汀(QD)、利福平(RD)、替加環(huán)素(TGc)、磷霉素(FOS)、氨芐西林(AM)的敏感性

6、;
　　 3.毒力基因檢測：采用PCR方法檢測所收集到的21株VSEF和19株VREF的常見毒力基因asal、gel、cyt、hyln、esp,了解并比較各基因出現(xiàn)的頻率及分布特征;
　　 4.多序列位點分型采用多位點序列分型(MLST)技術(shù)測定21株VSEF和19株VREF菌株7種管家基因atp、ddl、gdh、purk、gyd、psts、adk的基因序列,將其結(jié)果按MLST方法進行分類,與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行比較,獲得杭州

7、地區(qū)菌株的序列型(ST),并將VSEF與VREF的序列型(ST)進行比較。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.19株臨床分離的VREF多重耐藥情況嚴(yán)重,對糖肽類抗生素萬古霉素MIC均≥256μg/ml,替考拉寧MIC均≥24μg/ml,所有菌株對阿米卡星、氨芐西林耐藥,對慶大霉素高水平耐藥,但所有VREF菌株對利奈唑胺和替加環(huán)素敏感。21株臨床分離的VSEF菌株耐藥情況較輕,所有21株VSEF菌株對替考拉寧、利奈唑胺和替加環(huán)素

8、敏感,1株VSEF菌株對奎奴普丁/達福普汀耐藥,3株VSEF菌株對磷霉素耐藥。
　　 2.毒力基因檢測結(jié)果顯示,21株萬古霉素敏感屎腸球菌(VSEF)中有15株檢出毒力基因,陽性率為76.20％,不同毒力基因陽性率由高至低依次為esp(76.20％)、hyln(4.76％),其余3種毒力基因皆未檢出。19株萬古霉素耐藥屎腸球菌(VREF)中有13株檢出毒力基因,陽性率為68.42％,不同毒力基因陽性率由高至低依次為esp(68.

9、42％)、hyln(10.52％),asal、gel、cyt毒力基因各有一株陽性,陽性率皆為5.30％.從以上數(shù)據(jù)可以看出,此次檢測的萬古霉素耐藥及敏感屎腸球菌在毒力基因表達方面無明顯差異。近年來,腸球菌毒力基因或潛在的毒力基因在腸球菌中的分布研究較多,不同來源、不同種腸球菌毒力基因檢出率存在較大差異,可能是地區(qū)、人群、標(biāo)本等構(gòu)成不同而造成的。
　　 3.19株VREF分離株總共分為6個ST型,其中12株等位基因譜相同,為ST7

10、8型;ST203型、ST341型各2株,其它3株菌分屬3個不同的ST型;21株VSEF分離株總共可以分為14個ST型,其中5株菌序列型相同,為ST78型,其余16株菌分屬于13個不同的ST型。比較以上兩類屎腸球菌ST型,我們發(fā)現(xiàn)有兩個ST型,即ST78和ST203型在兩類屎腸球菌中均有出現(xiàn)。VREF和VSEF中ST78型分別出現(xiàn)12株與5株,各占63.2％與23.8％。從中我們可以看出,在VREF中ST78序列型占有明顯的優(yōu)勢,是優(yōu)勢型

11、別。對于VREF菌株,采用eBURST軟件分析后,發(fā)現(xiàn)ST78、ST341、ST18等15株菌為同一組分型,屬于克隆復(fù)合體CC17。而在VSEF中,共出現(xiàn)14個型別,5株為ST78型,占23.8％。本次實驗共40株屎腸球菌,共檢出ST78型19株,占47.5％,其余的序列型僅散在分布,散在分布在17個序列型中.因此可以看出,ST78型菌株分布最為廣泛,來源于不同的臨床標(biāo)本類型,尤其是杭州地區(qū)VREF的優(yōu)勢克隆,是否是我國VREF的優(yōu)勢克