動物源性腸球菌多位點序列分型及質(zhì)粒檢測.pdf

1、腸球菌是一類球形或卵圓形，不形成芽孢，常以成對或短鏈形式存在的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，且為條件性致病菌，廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中，是人和動物體胃腸道正常菌群之一，糞腸球菌和屎腸球菌是其優(yōu)勢菌種。臨床上由于抗生素的濫用，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使腸球菌的感染率不斷上升，成為感染的要病原菌。
　　雖然腸球菌被習慣性認為腸球菌是人和動物腸道共生的條件性致病菌，但它們能獲得特定的遺傳性狀，如毒力和耐藥性等因素，這也提高了其在復雜環(huán)境

2、中的適應能力，使得許多耐藥菌株大量出現(xiàn)和蔓延。腸球菌對現(xiàn)有的大多數(shù)抗菌藥物天然耐藥(如青霉素類、頭孢類抗菌藥物)，使其不易從感染部位清除。腸球菌易通過點突變和移動遺傳因素獲得耐藥性，最常見的方式是接合或者通過質(zhì)粒的水平傳輸或轉座子。有研究表明幾個確定質(zhì)粒無論是位點特異性重組或同源重組轉座子能共轉移和整合進染色體中。腸球菌中質(zhì)粒的流行性和重要性在動物、食品和人的野生型腸球菌耐藥性的傳播中具有重要作用是未知的。質(zhì)粒是可塑的和動態(tài)結構，它常被

3、認為不同的特定功能如維護（復制，穩(wěn)定性和拷貝數(shù)控制），轉讓（移動和轉移），致病性（致病島和毒力基因），降解途徑（生化特性）和抗性功能（抗微生物，重金屬）。最近的一些研究表明，這些模塊進化中保留該宿主特異性。
　　目前，國外對腸球菌致病性的研究較多，而國內(nèi)則較少。由于細菌的進化與所處環(huán)境有著非常密切的關系，所以不同地區(qū)的菌株會有著自身的特點，然而關于腸球菌的流行病學和種群結構知道很少。
　　本研究以90株不同來源腸球菌分離株為

4、研究對象，應用多位點序列分型(MLST)技術，根據(jù)GenBank公布的腸球菌基因組上7個不同管家基因設計特異性引物，糞腸球菌gdh葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、gyd甘油醛-3-磷酸脫氫酶、pstS磷酸ATP結合盒轉運、gik葡萄糖激酶、aroE草酸-5-脫氫酶、xpt黃嘌呤磷酸、yiqL乙酰-CoA乙酰轉移酶；adk（腺苷酸激酶），atpA（ATP合成酶，α亞基），ddl（D-丙氨酸連接酶），gyd（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、pstS（磷酸

5、ATP結合盒轉運體、purK（烯醇丙酮酸羧化酶ATP酶亞基）。以不同來源的腸球菌DNA為模板，通過PCR擴增出各個管家基因，經(jīng)膠回收純化，送公司進行測序，測序正確的進行數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜，構建等位基因圖譜并確立序列型(STs)，進而對90株腸球菌進行分型，系統(tǒng)分析菌株間的系統(tǒng)發(fā)育進化關系。然后進行菌群結構調(diào)查和菌群遺傳分析及流行病學分析。MLST結果分析表明腸球菌共54個ST型，其中糞腸球菌和屎腸球菌各占27個ST型。糞腸球菌主要

6、分布在ST16有9株；ST163、ST238和ST631分別4株；ST69、ST138、ST330、ST363、ST597分別有3株，其余各ST型到只包含1或2株菌。屎腸球菌主要分布ST178、ST190分別有2株菌，其余如ST22、ST26等各個ST僅僅包含1株菌。
　　隨后為研究腸球菌其質(zhì)粒攜帶情況，來自腸球菌公布的12種質(zhì)粒序列，根據(jù)其復制起始基因（rep)進行序列比對，使用其蛋白和 DNA水平80％的一致性，設計引物，摸索

7、不同質(zhì)粒的PCR條件，每個質(zhì)粒在所測菌株中進行試驗多次篩選直到有菌株中出現(xiàn)某種質(zhì)粒，然后送公司測序，將序列正確的作為陽性質(zhì)粒，再對其它菌株進行檢測。如果某種質(zhì)粒在所測菌株中均沒有出現(xiàn)，在本實驗中暫定為陰性。本研究對不同來源的65株腸球菌進行質(zhì)粒流行性測試結果表明，rep9家族在糞腸球菌中最普遍，而rep2在是屎腸球菌中最常見；65株糞腸球菌中有8株檢測到質(zhì)粒，所檢測出的質(zhì)粒分別是pIP501(分離株N9、N41)，pRE25（N1、N5