小鼠心臟成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多潛能干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:以小鼠心臟成纖維細(xì)胞(CFs)為靶點,利用慢病毒載體,向其中導(dǎo)入四個與胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc),誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞去分化成為誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞),從而為臨床治療心肌梗死性疾病提供可靠的細(xì)胞來源。
　　 方法:
　　 (1)病毒包裝培養(yǎng)工具細(xì)胞PlatE,Lip2000試劑盒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、c-myc、Klf4、GFP和helper質(zhì)粒,

2、包裝得到Oct4-Lentivirus,Sox2-Lentivirus,c-myc-Lentivirus,Klf4-Lentivirus,GFP-Lentivirus病毒(108-109Tu/ml)。用GFP為工具,測定病毒有效生物滴度(病毒量:細(xì)胞數(shù)=10:1)。
　　 (2)心臟成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng)取內(nèi)源性O(shè)ct4-GFP標(biāo)記的成年轉(zhuǎn)基因C57小鼠,麻醉后,開胸取心臟,剪碎,0.25％胰蛋白酶37℃分次熱消化。含10％胎牛血

3、清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),差速貼壁收集CFs,37℃常規(guī)培養(yǎng)。第3代細(xì)胞用于實驗。誘導(dǎo)前以5×104個細(xì)胞/孔密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
　　 (3)病毒轉(zhuǎn)染以各病毒比例Oct4:Sox2:c-myc:Klf4=1:1:1:1感染CFs,感染6h后,補(bǔ)足全培養(yǎng)基,24h后再次感染。誘導(dǎo)過程中使用iPS細(xì)胞專用培養(yǎng)基(無血清DMEM培養(yǎng)基+20％KSR,其余成分同ES細(xì)胞培養(yǎng)基)。
　　 (4)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)的細(xì)胞與飼細(xì)

4、胞共培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)及生物特性的變化;觀察細(xì)胞生長特征及形態(tài);并行堿性磷酸酶染色。
　　 (5)分子生物學(xué)測定提取CF細(xì)胞、Mef細(xì)胞、CF-iPS細(xì)胞、Mef-iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞的RNA,實時熒光定量PCR檢測內(nèi)源性多能性因子Oct4、Sox2、Nanog的表達(dá);熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性O(shè)ct4的GFP表達(dá);Sox2、Nanog行免疫熒光染色鑒定。
　　 (6)細(xì)胞多能性檢測在體畸胎瘤(teratoma)生成實驗:所得

5、iPS細(xì)胞以106個/部位注射于裸鼠背部皮下,觀察畸胎瘤形成情況并予形態(tài)學(xué)檢測。
　　 結(jié)果:
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察,CFs呈梭形或多角形,胞體較大,細(xì)胞漿透明:細(xì)胞核較大,呈橢圓形,可有2～3個核;細(xì)胞無自發(fā)性搏動,且分裂增殖旺盛,不易聚集成團(tuán),DDR2染色和波形蛋白免疫組化染色結(jié)果陽性,證實為成纖維細(xì)胞。
　　 (2)CFs在病毒以有效滴度感染后10-12d,可見部分CFs形態(tài)發(fā)生改變,逐漸形成干細(xì)胞樣克隆

6、,陽性克隆挑取傳代后呈ES細(xì)胞樣相似的形態(tài)及生長狀態(tài),可見細(xì)胞呈集落狀生長,克隆形態(tài)呈島狀或巢狀,克隆和周圍界限明顯,克隆內(nèi)細(xì)胞界限不清、排列緊密,細(xì)胞表面折光較強(qiáng)。
　　 (3)所得細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,CF細(xì)胞與Mef細(xì)胞的多能性因子mRNA表達(dá)均極低,而誘導(dǎo)后產(chǎn)生的iPS細(xì)胞顯示出較高的Oct4、Sox2、Nanog mRNA的表達(dá),其表達(dá)量與ES細(xì)胞及Mef源的iPS無差異;內(nèi)源性O(shè)ct4-