人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：通過異位表達(dá)某些轉(zhuǎn)錄因子，可以將體細(xì)胞重編程成誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPSCs)，它能避開ES細(xì)胞帶來的倫理問題，減少免疫排斥，給自體化干細(xì)胞基因治療的臨床應(yīng)用提供了可能性，為遺傳性疾病體外研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。
　　 方法：目前有多種方法可誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞，包括利用各種病毒載體、純化的重組蛋白質(zhì)、修飾的RNA分子等。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)多種小分子化合物也可促進(jìn)iPS的產(chǎn)生，如Vc能加速基因表達(dá)水平的改變，促進(jìn)前體iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、變成完全重編程的iPS細(xì)胞；VPA在重編程過程中，可上調(diào)ES特異性基因的表達(dá)，下調(diào)MEF特異性基因的表達(dá)。
　　 在本研究中，我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)，同時(shí)在誘導(dǎo)過程中添加Vc和VPA，最終獲得iPS細(xì)胞。然后，通過TRA-1-60/TRA-1-81活細(xì)胞染色，機(jī)械法挑取陽性克隆傳代培養(yǎng)。采取形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色以及干細(xì)胞表面多潛能標(biāo)

3、志物染色的方法對(duì)傳代后的克隆進(jìn)行初步鑒定。
　　 結(jié)果：(1)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，可獲得較高質(zhì)量的逆轉(zhuǎn)錄病毒；(2)誘導(dǎo)出的克隆在形態(tài)上與hES細(xì)胞相似，外源基因GFP不表達(dá)，經(jīng)過活細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)其 TRA-1-60/TRA-1-81有表達(dá)，挑取上述克隆傳代后，AP染色結(jié)果呈陽性，ES細(xì)胞表面標(biāo)志免疫熒光檢測呈陽性。傳至P7代，仍然具有ES樣克隆形態(tài)。