與慢加急性肝衰竭(ACLF)相關(guān)的乙型肝炎病毒(HBV)突變位點(diǎn)的研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎仍是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球范圍內(nèi)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染人群高達(dá)3.5億以上。HBV相關(guān)的慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是慢性肝炎患者死亡的重要原因，如果不進(jìn)行肝移植，其死亡率高達(dá)60-80％，每年大約有22600的患者死于肝衰竭。長(zhǎng)期以來(lái)宿主免疫一直被認(rèn)為是乙型肝炎加劇的主要原因，但是近年的研究結(jié)果表明病毒因素在

2、ACLF的發(fā)病中同樣起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一員，其DNA全長(zhǎng)約為3200個(gè)核苷酸，呈現(xiàn)部分雙鏈環(huán)狀。HBV基因組包含4個(gè)相互重疊的開放性讀碼框，分別編碼HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非結(jié)構(gòu)性蛋白X。由于HBV的復(fù)制過(guò)程包含前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄，其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，故HBV的突變率顯著高于其它的DNA病毒。HBV基因組的突變率可隨著病毒的復(fù)制不斷增加，其中一些突變可能與慢性肝炎的急性加劇相關(guān)，可作為ACLF的

3、預(yù)警的生物標(biāo)志物和抗病毒治療的靶標(biāo)。近來(lái)有研究表明基本核心啟動(dòng)子區(qū)的A1762T/G1764A突變與ACLF發(fā)病相關(guān)，A1846T、G1896A和C1913A/G位點(diǎn)的突變?cè)贏CLF患者中發(fā)生率顯著高于慢性肝炎患者。目前關(guān)于HBV突變和ACLF發(fā)病的關(guān)系主要集中于基本核心啟動(dòng)子區(qū)和前核心區(qū)，對(duì)HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突變位點(diǎn)與ACLF發(fā)病有關(guān)尚不清楚，為此本研究用HBV全基因組測(cè)序篩選出與ACLF發(fā)病

4、相關(guān)的HBV突變，并發(fā)現(xiàn)一些新的突變位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證，以期為ACLF的預(yù)警提供依據(jù)。
　　方法：
　　1 HBV全基因測(cè)序篩選與ACLF發(fā)病可能相關(guān)的HBV突變位點(diǎn)
　　1.1 Illumina高通量測(cè)序。樣本來(lái)自兩組(12例ACLF和12例慢性輕度乙型肝炎(mildchronic hepatitis B，CHB-M))年齡配對(duì)、性別和基因型分布無(wú)顯著差異患者，所有樣本HBV的DNA水平均＞100，000 co

5、pies/mL。首先從200μl的血清中提取病毒DNA，分3段重疊擴(kuò)增HBV全基因組。PCR產(chǎn)物在Genome AnalyzerⅡ平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序，然后處理高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。
　　1.2檢測(cè)上述樣本的肝功能指標(biāo)(ALT，AST，TBIL，PTA)，HBV血清標(biāo)記物和HBV DNA滴度。
　　1.3分析GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的HBV基因突變情況:在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索中國(guó)地區(qū)報(bào)道的ACLF和CHB-M相關(guān)的HBV全基因序

6、列共258條(ACLF患者序列143條，CHB-M患者序列115條)，分析其突變。
　　2 HBV突變與ACLF發(fā)病的關(guān)系的驗(yàn)證
　　2.1樣本。來(lái)自80例無(wú)癥狀攜帶者(asymptomatic carriers，ASC)、152例CHB-M、102例慢性重度乙型肝炎患者(severe chronic hepatitis B，CHB-S)和104例ACLF患者，共438例。
　　2.2從200μl血清中提取HBV DN

7、A，半巢式PCR擴(kuò)增HBV基因組目標(biāo)序列，PCR產(chǎn)物行常規(guī)Sanger測(cè)序。
　　2.3檢測(cè)上述樣本肝功能指標(biāo)，HBV血清標(biāo)記物和HBV DNA滴度。
　　結(jié)果：
　　1 Illumina高通量測(cè)序篩選結(jié)果
　　1.1作為質(zhì)量控制的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示:所測(cè)得的讀長(zhǎng)36bpDNA序列的不同位置發(fā)生測(cè)序錯(cuò)誤的頻率不一致，在20位堿基之后其堿基替換率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)位于序列的第30-36個(gè)堿基時(shí)，測(cè)序的錯(cuò)誤率顯著上升。為

8、了降低錯(cuò)配率，我們截取每個(gè)短片段序列前面的20bp進(jìn)行質(zhì)粒全長(zhǎng)的拼接。質(zhì)粒序列的總體誤差率為0.49％，其中每一百個(gè)核苷酸中錯(cuò)配堿基讀取頻率＞4％的核苷酸平均為2.4個(gè)，將4％作為區(qū)分真實(shí)突變和技術(shù)誤差的界線。
　　1.2 T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、 A2159G、 A2189C和G2345A為ACLF患者常見的突變位點(diǎn)，在12例ACLF患者中發(fā)生上述突變的病例數(shù)分別為10

9、例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。
　　1.3 T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、 A2159G、 A2189C和G2345A這9個(gè)位點(diǎn)的突變頻率在ACLF患者中顯著高于慢性輕度肝炎患者（P＜0.05或P＜0.01）。
　　1.4基本核心啟動(dòng)子區(qū)(basal core promoter，BCP)(A1762T/G1764A)突變?cè)?2例ACLF和12

10、例CHB-M患者中的發(fā)生率均為6例。其突變頻率在ACLF患者和慢性輕度肝炎患者未見顯著差異。
　　1.5從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)下載258條HBV全基因序列，分析上述突變的分布情況發(fā)現(xiàn):T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的發(fā)生率均顯著高于CHB-M，G2095A、G2345A和A1762T在ACLF組和CHB-M組間未見差異。分別對(duì)HBV B基因

11、型和C基因型患者的突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在B基因型的患者中，T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913A/G這5個(gè)位點(diǎn)突變?cè)贏CLF組中顯著高于CHB-M組;C基因型患者中，A1846T、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A這5個(gè)突變?cè)贏CLF組中顯著高于CHB-M組。A1762T/G1764A雙聯(lián)突變?cè)贐基因型和C基因型的ACLF患者中均未見顯著升高。
　　2 HBV點(diǎn)突變與ACLF發(fā)病的關(guān)

12、系的驗(yàn)證結(jié)果
　　2.1 ACLF組的B基因型比率顯著高于其余三組慢性乙型肝炎患者。
　　2.2 T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C這7個(gè)突變的發(fā)生率在ACLF組顯著高于ASC、CHB-M和CHB-S組（P＜0.05或P＜0.01）。
　　2.3 T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G這5個(gè)位點(diǎn)在HBV基因型B的

13、感染者中顯著高于HBV基因型C感染者。
　　2.4對(duì)ASC、CHB-M、CHB-S和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突變進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):以ASCs為對(duì)照組，B基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913A/G突變?cè)贑HB-S和ACLF組中均顯著升高; C基因型毒株感染者中，A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C突變?cè)贏CLF組和CHB-S組中顯著升高。以CHB-M為對(duì)照組，H

14、BV B基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913A/G和A2159G/C在ACLF患者中顯著升高;C基因型毒株感染者中，G285A、A1846T/G、G1896A和C1913A/G在ACLF患者中顯著升高。當(dāng)以CHB-S為對(duì)照時(shí)，基因型B毒株感染者中，A2159G/C和A2189T/C在ACLF組中顯著升高。
　　2.5與非ACLF組比較，B基因型毒株的T216C、G285A、A1846T/G、G189

15、6A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C與ACLF密切相關(guān)，而C基因型毒株的G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G和A2159G/C與ACLF密切相關(guān)。
　　2.6多因素分析顯示T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C是ACLF發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　2.7 T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C的兩個(gè)或以上的聯(lián)合突變與ACLF發(fā)生密切相關(guān)。

16、
　　2.8“含C216的聯(lián)合突變”，“含A/G1913的聯(lián)合突變”，“含G/C2159的聯(lián)合突變”對(duì)ACLF診斷具有較高的特異性。
　　結(jié)論：
　　1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易發(fā)展為ACLF。
　　2 T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C突變?yōu)锳CLF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中T216C和A2159G/C系本研究新發(fā)現(xiàn)的ACLF發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(T216C位點(diǎn)已申請(qǐng)國(guó)際專利