乙型肝炎病毒變異與慢加急性肝衰竭發(fā)病關(guān)系的研究.pdf

1、背景：
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致病毒相關(guān)性慢性肝臟疾病最常見的因為之一。據(jù)估計全世界約有3億慢性HBV攜帶者，我國的HBV感染者約為1.2億。慢性HBV感染可引起包括無癥狀攜帶、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化和肝癌，或進展為肝衰竭(liver failure，LF)的一系列肝臟疾病譜。慢加急性肝衰竭(acute-on-chroni

2、c liver failure，ACLF)是在慢性乙肝病毒感染基礎(chǔ)上，由于病毒復(fù)制、感染、內(nèi)毒素血癥及勞累飲酒等誘因，引起的肝臟急性炎癥加重，肝臟發(fā)生大塊或亞大塊壞死，導(dǎo)致病情急劇加重，引起肝衰竭。中國80％的ACLF患者與HBV感染相關(guān)。ACLF的死亡率很高，在未進行肝移植的患者中高達(60-80)％。
　　 在CHB基礎(chǔ)上進展為肝衰竭的機制復(fù)雜，HBV病毒和機體免疫的因素都起著重要的作用。既往文獻報道HBV病毒變異，特別是前

3、C區(qū)終止密碼了(G1896A，PC)和基本核心啟動子(basie core promoter，A1762T/G1764A，BCP)的變異率在急性肝衰竭的患者中明顯升高；PC和BCP變異下調(diào)了作為免疫耐受原的HBeAg，血清中HBeAg下降或缺如，導(dǎo)致HBcAg表達增加，使Th1輔助細胞發(fā)動細胞毒性T細胞(cytoxic T lymphocyte，CTL)攻擊感染的肝細胞，從而導(dǎo)致肝細胞壞死。
　　 HBcAg作為CTL靶抗原，包

4、含有多個能被CTL識別的表位(epitope)。表位是特異性細胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的主要原動力，處于免疫識別和免疫激活的核心位置。核苷酸的轉(zhuǎn)換、插入和缺失可導(dǎo)致氨基酸的有義突變，當這種突變影響到病毒的特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞表位的序列和序列構(gòu)象時，進一步會影響與HLA分子的結(jié)合力或與B、T淋巴細胞受體的結(jié)合力，從而影響宿主針對病毒的免疫應(yīng)答能力。在一些腫瘤和其他病毒細胞免疫應(yīng)答方面，研究已證實基因變異會導(dǎo)致T細胞表位漂移(epitop

5、e drift)，從而改變了表位的免疫原性，進而影響疾病的發(fā)展與預(yù)后。
　　 目的：
　　 以中國廣東地區(qū)ACLF患者為主要對象，從HBV變異影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和影響宿主免疫應(yīng)答兩個方面，探討病毒變異與ACLF患者發(fā)病的關(guān)系。
　　 方法：
　　 39例ACLF患者和38例嚴重肝炎活動患者(severe hepatitis B，SHB)作為主要研究對象。其中ACLF診斷標準：在慢性肝病的基礎(chǔ)上急性起病，15

6、天至26周出現(xiàn)以下臨床表現(xiàn)者：①極度乏力，有明顯的消化道癥狀；②黃疸迅速加深，血清總膽紅素(TB)≥正常值上限10倍，或每日上升≥17.1μmol/l；③凝血酶原時間明顯延長，凝血酶原活動度(PTA)≤40％。SHB定義參照文獻的報道：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≥600U/l、TB≥51.3μmol/l和PTA≤50％。作為對照組的44例CHB患者定義為：HBV表面抗原(HBsAg)陽性半年以上，出現(xiàn)的輕度或中度肝炎活動，即ALT波動于(8

7、0-400)U/l和TB≤17.1μmol/。以上患者臨床和實驗室檢查均無明顯肝硬化征象。ACLF和SHB的患者平均隨訪10.6月(最長17個月，最短3個月)。采集患者的臨床資料和血清標本。抽提DNA，通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增和測序HBV前C/C區(qū)，通過克隆測序的方法對HBV混合株感染加以驗證。通過生物預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI和BIMAS分析線性Th細胞表位和CTL表位發(fā)生變異

8、后與HLA分子的結(jié)合能力，用HBcAg X線衍射3D結(jié)構(gòu)分析B細胞表位變異后構(gòu)型的改變。用五聚體染色(pentamerstaining)技術(shù)探討表位免疫原性的改變。
　　 結(jié)論：
　　 1)根據(jù)Logistic回歸篩選與從SHB進展為ACLF相關(guān)的因素包括：TB升高和PTA降低。在ACLF中，PTA下降與不良結(jié)局相關(guān)。
　　 2)基因B型在ACLF和SHB兩組比率均高于CHB組，且SHB組與CHB組比較有統(tǒng)計學(xué)意

9、義。這表明在中國南方地區(qū)基因B型與嚴重的肝臟炎癥活動發(fā)病相關(guān)。
　　 3)BCP(A1762T/G1764A)和PC(G1896A)變異率在ACLF組明顯高于CHB組。ACLF組HBV發(fā)生BCP-/PC+和BCP+/PC+的比例明顯高于CHB組，而BCP-/PC-比例明顯低于CHB組。這個結(jié)果證實了A1762T/G1764A和G1896A高變異與ACLF發(fā)病的相關(guān)性。
　　 4)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BC

10、P-/PC+和BCP+/PC+模式中HBeAg的陰性率逐步升高；而且BCP-/PC+和BCP+/PC+模式下調(diào)HBeAg的作用與其他兩種模式相比明顯增強；在單變異模式中PC變異下調(diào)HBeAg作用強于BCP變異；且在ACLF組BCP+/PC+和PC單變異的比例明顯高于CHB組。這表明PC+和BCP+/PC+模式導(dǎo)致的HBeAg陰性與ACLF發(fā)病相關(guān)。
　　 5)C基因編碼區(qū)發(fā)生變異的頻率在ACLF組明顯高于CHB組。ACLF中氨基

11、酸變異率明顯升高的位點絕大部分位于表位區(qū)域。統(tǒng)計各個表位區(qū)變異的頻率，在ACLF組均高于CHB組。這說明表位變異可能在ACLF發(fā)病中起著重要的作用。
　　 6)aa5和aa60變異存在明顯的協(xié)同關(guān)系。兩位點盡管在線性位置相隔遠，但在HBcAg空間構(gòu)型上位置相鄰，分享HBcAg四聚體中同一個螺旋束。通過預(yù)測分析肽段發(fā)生aa5 P-T的變異后與HLA-A*0201結(jié)合力增強；提示aa5變異后可能提高表位的免疫原性、誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)

12、；而aa5 P-T的變異在ACLF中明顯升高(52.63％)；表明aa5T與ACLF的發(fā)病相關(guān)。aa60由于與aa5空間位置相鄰，可能在極性、PH值、親水性等多個因素的影響下，出現(xiàn)協(xié)同變異。
　　 7)HLA-A2限制性CTL表位HBcAg18-27(Ⅴ27)在ACLF組的比率明顯升高，且隨訪后ACLF患者中，HLA-A2陽性的患者均變異127；且HBcAg18-27(Ⅴ27)特異性CD8細胞的頻數(shù)高于HBcAg18-27(Ⅰ2