乙型慢加急性肝衰竭患者HBV基因突變的研究.pdf

1、目的：既往有研究提示HBV核苷酸突變可能和乙型肝炎患者的病情加重有關(guān)，但與慢性乙型肝炎患者慢加急性肝衰竭（ACLF）之間的關(guān)系還不明確，少數(shù)研究提示可能和前C區(qū)的突變有一定的關(guān)系，但仍沒(méi)有定論。因此需要進(jìn)一步研究以明確HBV突變與ACLF是否相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)與ACLF相關(guān)的新的HBV核苷酸突變位點(diǎn)。
　　 方法：本試驗(yàn)采用回顧性研究，縱向及橫向?qū)Ρ鹊难芯糠椒ā?br>　　 （1）縱向?qū)Ρ妊芯浚哼x取慢性HBV感染者6名。其中，4名為

2、ACLF患者（P1-P4），2名為肝硬化（LC）患者（P5、P6）。P1-P4選取ACLF發(fā)生前和ACLF發(fā)生時(shí)血清標(biāo)本各1份；P5、P6各留取慢性乙型肝炎（CHB）階段和LC階段血清標(biāo)本各1份。對(duì)每位患者的2份標(biāo)本進(jìn)行HBV全基因組PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒，每份標(biāo)本選取3-4個(gè)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增后測(cè)序。
　　 （2）橫向?qū)Ρ妊芯浚哼x取于慢性HBV感染者166例作橫向?qū)Ρ妊芯?。其中ACLF49人，cHB45人，LC

3、45人，肝細(xì)胞癌（HCC）27人。對(duì)每位患者血清標(biāo)本進(jìn)行提取HBV DNA，進(jìn)行BCP/前C區(qū)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序。通過(guò)Vector NTI Suite 9.0軟件對(duì)序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找出與ACLF有關(guān)的核苷酸突變位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：（1）縱向研究提示：與LC患者比較，ACLF患者在疾病發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)更多的核苷酸突變。從突變的位置看，ACLF患者核苷酸突變一致且集中的區(qū)域主要位于前C基因內(nèi)。4名ACLF患者中，有2名

4、或2名以上患者可見(jiàn)的共同突變位點(diǎn)有：nt53、nt1846和nt1896突變。C區(qū)1913位在P2也見(jiàn)有縱向突變，橫向比較見(jiàn)P1、P2均見(jiàn)有此位點(diǎn)突變，而P5、P6均未發(fā)現(xiàn)。
　　 （2）橫向研究提示：nt1753、nt1762、nt1764、nt1846、nt1896和nt1913位核苷酸突變率在CHB、LC、ACLF和HCC四組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均<0.01）。但在ACLF組與LC組之間，僅nt1846和nt1913突變有顯

5、著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）；在ACLF組與HCC組之間，nt1762、nt1846和nt1913突變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。聯(lián)合突變分析提示：最常見(jiàn)的是A1762T/G1764A雙突變，陽(yáng)性率高達(dá)70.5％（117/166）；其它常見(jiàn)的兩聯(lián)突變還有A1846T/G1896A[25.9％（43/166）]、A1846T/C1913（A or G）[18.7％（31/166）]和A1752G/C1799G[10.8％（18/16

6、6）]等。在多位點(diǎn)聯(lián)合突變中，上述突變組合經(jīng)常一同出現(xiàn)，組成更為復(fù)雜的突變模式。突變數(shù)量與疾病進(jìn)展有平行關(guān)系，ACLF患者可見(jiàn)更多的聯(lián)合突變。突變對(duì)HBV DNA水平的影響：nt1753、nt1764、nt1846、nt1896和nt1899突變的患者HBV DNA水平要低于野生株患者；并且聯(lián)合突變者HBV DNA水平更低。與HBeAg狀態(tài)有關(guān)的突變位點(diǎn)有G1896A、G1899A、T1753（G或C）、A1846T、C1913（A或G

7、）和G1915（A或C）。核苷酸突變與基因型的關(guān)系：nt1752、nt1799、nt1846三個(gè)位點(diǎn)的變異率在B型患者中高于C型；nt1753、nt1762、nt1764、nt1915的變異率在C型患者中高于B型。BCP/前C核苷酸突變率在以CHB為基礎(chǔ)和以LC為基礎(chǔ)的ACLF患者中無(wú)顯著性差異。多因素分析結(jié)果提示nt1913（C→A or G）和nt1846（A→T）突變是預(yù)測(cè)ACLF的有效因素（比數(shù)比分別為3.875和3.151，P