白介素12真核表達(dá)質(zhì)粒及電穿孔對(duì)新城疫F基因DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種高度接觸性、高死亡的禽類傳染病，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病。隨著近幾年基因Ⅶ型毒株的流行，使用傳統(tǒng)滅活苗和弱毒苗往往不能取得理想的免疫效果。因此，開(kāi)展新城疫基因工程疫苗的研究具有重要的意義。DNA疫苗被稱為“第三代疫苗”，能夠刺激機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是最具有潛力的基因工程苗之一。

2、為了深入研究新城疫DNA疫苗，本研究利用含β-actin啟動(dòng)子和 CMV增強(qiáng)子的載體質(zhì)粒 pCAGGS成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pCAG-F和pCAG-IL12，通過(guò)電穿孔導(dǎo)入的方式將質(zhì)粒輸送到動(dòng)物體內(nèi)，研究電穿孔免疫方式和雞IL12重組表達(dá)質(zhì)粒共免疫方式對(duì)pCAG-F DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用。
　　首先，以基因Ⅶ型新城疫病毒CHICKEN/CH/GD/GM-03作為F基因的供體，在上游引入Kozak序列，構(gòu)建出pCAG-F真

3、核表達(dá)質(zhì)粒，分別以電穿孔或者普通肌肉注射的方式免疫SPF雞群，通過(guò)檢測(cè)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，綜合評(píng)價(jià)電穿孔技術(shù)對(duì)新城疫DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用，并通過(guò)免疫保護(hù)試驗(yàn)對(duì)疫苗效果進(jìn)行評(píng)估。血清抗體中和試驗(yàn)結(jié)果顯示：在二免后2周pCAG-F/EP組的針對(duì)NDV GM株的中和抗體滴度高于pCAG-F/ IM組。MTT法檢測(cè)免疫雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果顯示：pCAG-F/ IM組和EP組T淋巴細(xì)胞對(duì)CoA的刺激均有明顯的反應(yīng)

4、性。二免后14 d，pCAG-F/ IM組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），而EP組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.001）。試驗(yàn)結(jié)果表明電穿孔的免疫方式能夠顯著增強(qiáng)新城疫F基因 DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。二免后14 d進(jìn)行新城疫病毒強(qiáng)毒攻擊，pCAG-F/IM組存活率為90％，表明F基因作為新城疫基因的免疫原基因具有可行性。pCAG-F/EP組存活率為100%，說(shuō)明電穿

5、孔的免疫方式能夠增強(qiáng)pCAG-F的攻毒保護(hù)效果。拭子病毒分離的結(jié)果表明，電穿孔的免疫方式能夠降低排毒率和縮短排毒時(shí)長(zhǎng)。
　　其次，構(gòu)建表達(dá)雞源IL-12的真核表達(dá)質(zhì)粒，在電穿孔技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討分子佐劑IL-12對(duì)新城疫F基因DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。血清中和抗體試驗(yàn)結(jié)果顯示：在三免后2周pCAG-F+pCAG-IL12/EP組和pCAG-F/EP組相比，中和抗體差異極顯著（P<0.01）。MTT法檢測(cè)免疫雞外周血T淋巴細(xì)胞

6、增殖試驗(yàn)，結(jié)果顯示：二免后14 d，pCAG-F/EP組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），pCAG-F+pCAG-IL12/EP組 T細(xì)胞 CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.001）。pCAG-F+pCAG-IL12/EP組和pCAG-F/EP組相比T細(xì)胞CoA刺激的OD值差異顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，pCAG-IL12質(zhì)粒能夠增強(qiáng)新城疫重組 DNA疫苗pCAG-F的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答

7、。拭子病毒分離的結(jié)果表明，pCAG-F+pCAG-IL12/EP組僅第3 d時(shí)，有1只雞（1/10）喉頭可分離到病毒，這說(shuō)明共免疫pCAG-IL12對(duì)重組DNA疫苗pCAG-F具有較明顯的免疫增強(qiáng)作用，能夠有效地抑制病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制和排毒。
　　綜上，本研究制備了新城疫病毒F基因DNA疫苗，并評(píng)估了電穿孔基因?qū)爰夹g(shù)和使用pCAG-IL12質(zhì)粒作為佐劑均對(duì)新城疫pCAG-F DNA疫苗的免疫效果的影響，為新一代新城疫DNA疫苗的