新城疫耐熱疫苗載體的GFP表達(dá)優(yōu)化及免疫原性研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)對(duì)禽類具有高度的傳染性和致病性，世界范圍內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生幾次大規(guī)模流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的損失巨大。病原體新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)是單股負(fù)鏈RNA病毒，結(jié)構(gòu)蛋白包括核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、神經(jīng)氨酸酶-血凝素（HN）和聚合酶蛋白(L)。疫苗接種是目前防控新城疫的行之有效的方法，新城疫疫苗中的弱毒活疫苗具有副作用小、接種

2、方式便捷多樣等優(yōu)點(diǎn)，為養(yǎng)殖戶節(jié)約免疫時(shí)間和人力成本，受到養(yǎng)殖企業(yè)尤其是廣大偏遠(yuǎn)散養(yǎng)戶的歡迎。
　　本課題組前期進(jìn)行了NDVV4株的選育工作，獲得了耐熱低毒且適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的TS09-C株，進(jìn)一步成功構(gòu)建了TS09-C株的反向遺傳操作系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了外源GFP基因在rTS09-C株的插入和表達(dá)，這些研究成果為本課題在分子水平繼續(xù)篩選全長(zhǎng)cDNA上合適的外源基因表達(dá)位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。參考了相關(guān)文獻(xiàn)，我們?cè)诮Y(jié)構(gòu)基因NP、M、L的轉(zhuǎn)錄起始

3、點(diǎn)分別插入GFP基因，將GFPORF與病毒結(jié)構(gòu)基因融合轉(zhuǎn)錄，同時(shí)為了降低GFP插入對(duì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響，在GFPORF的5'端加上結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)ATG后的60bp序列，GFP基因與結(jié)構(gòu)基因(SG)整合為融合轉(zhuǎn)錄框5'UTR-60Head-GFP-2AUbi-SG-3'UTR，表達(dá)后的融合蛋白被裂解為GFP和病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
　　本課題中應(yīng)用限制酶內(nèi)切pTS09-C質(zhì)粒，分別獲得3個(gè)線性化載體，PCR擴(kuò)增插入序列GFP和2AUbi

4、，In-Fusion連接GFP、2AUbi和線性化載體，獲得了3個(gè)全長(zhǎng)質(zhì)粒，外源序列的DNA測(cè)序結(jié)果及全長(zhǎng)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期相符，說(shuō)明3個(gè)全長(zhǎng)質(zhì)粒構(gòu)建成功。利用反向遺傳操作技術(shù)將3個(gè)全長(zhǎng)質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光信號(hào)，及時(shí)收獲陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞，細(xì)胞液的HA，real-timePCR和IFA的檢測(cè)結(jié)果均為NDV陽(yáng)性，Western-Blot檢測(cè)GFP的結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明表達(dá)GFP的NDV拯救成功

5、，按照GFP嵌入位置不同將重組病毒分別命名為rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、rTS-GFP/L，這也是首次利用融合表達(dá)自切割方式成功拯救出表達(dá)外源GFP蛋白的NDV。
　　本課題比較了3株重組病毒rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、rTS-GFP/L的增殖速率和GFP表達(dá)效率。方法是將3株病毒均按0.1MOI病毒量接種BHK-21細(xì)胞，接毒后24h、48h、72h、96h時(shí)間點(diǎn)分別采集熒光圖片、收取培養(yǎng)液上清和受感

6、染的細(xì)胞。測(cè)定培養(yǎng)液上清的TCID50，并繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示rTS-GFP/M增殖效率最高，與親本株rTS09-C基本一致，而rTS-GFP/M和rTS-GFP/L增殖效率都有不同程度降低。綠色熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)觀測(cè)圖結(jié)果顯示rTS-GFP/M的熒光強(qiáng)度最高，對(duì)受感染細(xì)胞的GFP進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示rTS-GFP/M的條帶最亮，說(shuō)明rTS-GFP/M既保持了細(xì)胞內(nèi)高增殖特性又可以高效表達(dá)GFP，綜合比較的結(jié)果

7、表明結(jié)構(gòu)基因M轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)是較合適的外源基因表達(dá)位點(diǎn)。純化后的rTS-GFP/M株病毒顆粒進(jìn)行GFP的Western-Blot檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性，表明GFP嵌入到病毒顆粒，激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞核中也存在GFP，但rTS-GFP/M只存在細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明rTS-GFP/M表達(dá)的GFP以嵌合和游離兩種形式存在。
　　疫苗免疫保護(hù)率試驗(yàn)中使用105.0EID50rTS-GFP/M和V4免疫1日齡SPF雛雞，免疫2周后采血，結(jié)果顯示rTS-

8、GFP/M組血清HI抗體較低。進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，使用1060EID50致死劑量NDV強(qiáng)毒CA02，結(jié)果rTS-GFP/M組和V4組雛雞達(dá)到完全保護(hù)率。
　　綜上所述，我們報(bào)道了3株表達(dá)GFP的NDV，即rTS-GFP/NP、rTS-GFP/M、rTS-GFP/L，通過(guò)比較它們的增殖速率和GFP的表達(dá)效率，確定了融合轉(zhuǎn)錄自切割方式，在M基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(rTS-GFP/M)是較為合適的外源基因表達(dá)位點(diǎn)。免疫rTS-GFP/M后的SP