雞IL-18的原核表達蛋白及真核表達質(zhì)粒對IBD疫苗的免疫增強作用研究.pdf

1、白細胞介素18(IL-18)具有廣泛的生物學活性，能夠促進γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生，刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化，增強NK細胞的殺傷活性，在介導細胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。對人和哺乳動物IL-18的研究已有許多報道。本研究室在2001年開展雞白細胞介素18(ChIL-18)的研究，先后構(gòu)建ChIL-18的重組質(zhì)粒和原核表達系統(tǒng)、真核質(zhì)粒及其表達系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上，對純化后的原核表達的重組雞白細胞介素18產(chǎn)物進行生物學活性檢測，對

2、其在生產(chǎn)中的應用做了初步研究，同時對影響ChIL-18原核表達產(chǎn)物生物學活性的因素也進行了探討。 試驗一不同復性方法對rChIL-18原核表達蛋白復性率和生物學活性的影響 研究利用不同的復性方法輔助rChIL-18原核表達蛋白的復性，以提高雞IL-18重組蛋白復性率，獲得更多具有良好活性的蛋白。將重組原核表達質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細胞大腸桿菌BL21(DE3)，并用IPTG于37℃誘導培養(yǎng)獲得表達。表達產(chǎn)

3、物主要以包涵體的形式存在。包涵體經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性，然后利用鹽酸胍-去離子水透析法、鹽酸胍-谷胱甘肽變性復性法和人工分子伴侶系統(tǒng)法分別輔助蛋白復性。復性產(chǎn)物經(jīng)透析純化后，利用淋巴細胞增殖試驗來檢測其活性。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，表達產(chǎn)物是與ChIL-18重組蛋白相符的Mr約44000的蛋白條帶。利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助復性的方法獲得的復性率最高，復性率為42.54％。雞淋巴細胞增殖試驗表明

4、，表達產(chǎn)物對雞淋巴細胞具有明顯誘導增殖作用。由上述試驗顯示，人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復性，獲得較高的復性率。其產(chǎn)物具有良好的生物學活性，為下一步雞IL-18重組蛋白的應用研究奠定了試驗基礎(chǔ)。 試驗二人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白復性過程中影響因素的研究 將重組原核表達質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細胞大腸桿菌BL21(DE3)，并用IPTG于37℃誘導培養(yǎng)獲得表達。表達的包涵體

5、經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性。然后按照試驗設計，考察不同濃度組成的人工分子伴侶體系對不同濃度雞IL-18重組蛋白復性率的影響。試驗結(jié)果表明，利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白的復性存在最佳的條件，優(yōu)化該條件能夠提高該融合蛋白的復性率，且產(chǎn)物都具有良好的生物學活性，為雞IL-18重組蛋白的進一步應用研究奠定了試驗基礎(chǔ)。 試驗三雞IL-18原核表達蛋白及真核表達質(zhì)粒對IBDV滅活疫苗免疫增

6、強作用的研究 將雞IL-18原核表達蛋白的復性產(chǎn)物和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1TOPO-mCh1L18分別與IBDV滅活疫苗聯(lián)合應用，通過中和抗體檢測和T淋巴細胞對ConA增殖反應試驗，研究其對IBDV滅活疫苗的免疫增強作用。結(jié)果顯示，在接種后第21、28、35及42d時蛋白組和質(zhì)粒組與單純疫苗組抗體水平差異顯著(P＜0.05)，且蛋白組比質(zhì)粒組效果更明顯一些；其T淋巴細胞的增殖反應也強于單純疫苗組，尤其是在免疫14天后增殖效

7、果明顯高于單純疫苗組(P＜0.05)。接種42d后進行攻毒保護性試驗，結(jié)果表明：同時接種雞IL-18原核表達蛋白復性產(chǎn)物和真核表達質(zhì)粒的試驗組雞獲得93.3％的保護率，而單純疫苗接種組的保護率為73.3％。雞IL-18的原核表達蛋白和真核表達質(zhì)粒均具有明顯的增強IBD滅活疫苗免疫效果的作用。 結(jié)論： 人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復性，獲得較高的復性率。其產(chǎn)物具有良好的生物學活性，為下一步雞IL-18