犬白細胞介素-7基因?qū)θ毿〔《綝NA疫苗的免疫增強作用.pdf

1、[目的]
　　 細胞因子具有明顯的免疫佐劑作用,它通過在體內(nèi)緩慢持久的釋放,從而增強疫苗的免疫作用。白介素-7是動物體一種重要的多功能細胞因子,白介素-7作為白介素家族的一名重要成員它不僅在促進B細胞、T細胞的形成和發(fā)育中起重要作用,而且在協(xié)同其它細胞因子提高機體免疫能力等方面發(fā)揮著重要作用。為了驗證白介素-7基因?qū)NA疫苗的免疫增強作用,本試驗利用犬細小病毒VP2 DNA疫苗與重組犬白介素-7DNA疫苗共同免疫小鼠,在小鼠體

2、內(nèi)分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增強作用。
　　 [方法]
　　 首先從犬脾臟中分離出犬脾淋巴細胞,然后用conA刺激犬脾淋巴細胞,利用Trizol法提取犬總RNA,并翻轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR擴增出cIL-7基因,然后將cIL-7基因插入到真核表達載體pcDNA3.1A中,分別構(gòu)建成與Myc/His標簽融合和非融合的cIL-7真核分泌型表達載體pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。將構(gòu)建好的

3、融合標簽表達載體pcDNA-cIL7/MH質(zhì)粒利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,使其進行瞬時表達,同時將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞作為對照。培養(yǎng)48小時后,收集培養(yǎng)基利用三氯乙酸沉淀法沉淀蛋白,以Western-blot檢測構(gòu)建的表達載體能否介導(dǎo)cIL-7基因在真核細胞中進行分泌表達。然后用本室之前已經(jīng)構(gòu)建好的VP2表達載體pcDNA-CD5-VP2與非融合標簽的pcDNA-cIL7載體共免疫小鼠,并設(shè)pcDNA

4、3.1、pcDNA-CD5-VP2單免疫小鼠和pcDNA-cIL7單免疫小鼠作為對照,免疫小鼠方法采用肌肉注射方法,DNA質(zhì)粒用DNA無內(nèi)毒素試劑盒抽提,將抽提好的DNA質(zhì)粒注入小鼠的后腿肌肉。小鼠共進行免疫兩次,第二次免疫在第一次免疫后14 d進行。免疫后,分別在兩次免疫前2 d和一免后35 d,從小鼠眼角進行活體采血,分離血清。通過ELISA方法檢測抗體水平,并通過淋巴細胞增殖實驗和ELISA方法分別檢測免疫后35 d小鼠脾臟淋巴細

5、胞刺激指數(shù)和γ-干擾素的表達水平。
　　 [結(jié)果]
　　 結(jié)果表明,本實驗擴增的cIL-7基因序列與GenBank中犬的序列完全一致。構(gòu)建的表達載體能夠介導(dǎo)cIL-7基因在HEK293T細胞中進行分泌表達。動物免疫試驗結(jié)果顯示,cIL-7與VP2共免疫組小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價分別極顯著和顯著高于VP2單免疫組(P＜0.01和P＜0.05);共免疫組小鼠淋巴細胞刺激指數(shù)和γ-干擾素表達水平也顯著高于VP2單免疫組