Notch信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)因子SEL1L對(duì)體外培養(yǎng)小鼠切牙頸環(huán)細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、牙冠發(fā)育完成后，上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS）的形成啟動(dòng)了牙根發(fā)育已成為共識(shí)，然而牙根發(fā)育啟動(dòng)的分子機(jī)制尚不明了。嚙齒類(lèi)動(dòng)物切牙根尖端唇側(cè)干細(xì)胞龕可以持續(xù)分化成釉細(xì)胞并形成釉質(zhì)，使切牙終生持續(xù)生長(zhǎng)。而磨牙則跟人類(lèi)的牙齒一樣形成HERS，啟動(dòng)了牙根發(fā)育。因此嚙齒類(lèi)動(dòng)物切牙常作為牙根發(fā)育障礙的研究模型。Notch信號(hào)有助于維持切牙頸環(huán)干細(xì)胞龕，SEL1L是Notch信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。前期研究

2、發(fā)現(xiàn)SEL1L在磨牙強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，切牙弱陽(yáng)性表達(dá)，推測(cè)SEL1L有助于打破頸環(huán)干細(xì)胞微環(huán)境，形成HERS并啟動(dòng)牙根發(fā)育。
　　本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RT-PCR等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)切牙頸環(huán)細(xì)胞SEL1L過(guò)表達(dá)，觀察其對(duì)頸環(huán)細(xì)胞凋亡的影響，以探討SEL1L是否通過(guò)促進(jìn)頸環(huán)細(xì)胞的凋亡，打破了頸環(huán)結(jié)構(gòu)中的干細(xì)胞微環(huán)境，從而使頸環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p層細(xì)胞的上皮根鞘結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)了牙根發(fā)育。主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　實(shí)

3、驗(yàn)一酶消化組織塊法原代培養(yǎng)小鼠切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞
　　取出生后7～8天（postnatal7-8day,PN7～8d）的昆明小鼠，斷頸處死后提取切牙根尖端唇側(cè)頸環(huán)組織。I型膠原酶和dispaseⅡ蛋白酶混合液消化后接種組織塊進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，胰酶差別消化法去除成纖維細(xì)胞以獲得純化的上皮細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-7天后組織塊周?chē)梢?jiàn)梭形成纖維細(xì)胞及多角形上皮細(xì)胞混合存在，采用胰酶差別消化后得到多角形、聚

4、集生長(zhǎng)鋪路石樣純化的上皮細(xì)胞，角蛋白陽(yáng)性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用酶消化組織塊法成功培養(yǎng)切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞，角蛋白免疫染色驗(yàn)證其為上皮來(lái)源。操作簡(jiǎn)便易學(xué)，兼具酶消化法及組織塊法的優(yōu)點(diǎn)。小鼠切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞成功培養(yǎng)為進(jìn)一步研究目的分子SEL1L的功能打下了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二小鼠pEGFP-N2-SEL1L表達(dá)載體鑒定及頸環(huán)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　采用DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并篩選pEGFP-N2-SEL1L重組質(zhì)粒，目的基因PCR及酶切鑒定目的基因陽(yáng)

5、性表達(dá)的重組質(zhì)粒后測(cè)序。選取濃度及純度適合的質(zhì)粒利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染頸環(huán)上皮細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)16～18h后可見(jiàn)單個(gè)克隆菌落長(zhǎng)出，挑取菌落并搖菌，提取質(zhì)粒。PCR可見(jiàn)目的基因條帶，單酶切及雙酶切后均可見(jiàn)相應(yīng)DNA條帶。測(cè)序結(jié)果顯示目的基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中SEL1L基因高度重合。轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)成功提取并鑒定目的基因SEL1L已與空白質(zhì)粒相連接的重組質(zhì)粒；并采用脂質(zhì)體2000成功轉(zhuǎn)染頸環(huán)上皮細(xì)胞，

6、實(shí)現(xiàn)SEL1L的過(guò)表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三pEGFP-N2-SEL1L轉(zhuǎn)染小鼠切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞鑒定及凋亡檢測(cè)
　　RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后頸環(huán)上皮細(xì)胞SEL1L、Notch1及Hes1的表達(dá)，判斷目的基因是否成功轉(zhuǎn)染，SEL1L表達(dá)是否上調(diào)。采用DAPI染色進(jìn)行凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空載體對(duì)照組相比較，重組質(zhì)粒組SEL1LmRNA表達(dá)增強(qiáng)，Notch1及Hes

7、1mRNA表達(dá)減弱。重組質(zhì)粒組細(xì)胞呈凋亡形態(tài)改變的明顯多于空載體對(duì)照組，Caspase-3mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2mRNA表達(dá)減弱。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR檢測(cè)SEL1L、Notch1及Hes1mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了已將pEGFP-N2-SEL1L重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染切牙頸環(huán)細(xì)胞，并且SEL1L可發(fā)揮功能；采用DAPI染色及RT-PCR技術(shù)成功檢測(cè)出SEL1L過(guò)表達(dá)的頸環(huán)上皮細(xì)胞凋亡率增加。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SEL1L