神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景：血管新生(從已存在的血管形成新的血管)與許多生理過(guò)程和病理變化密切相關(guān)，并受到內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial eell，EC)遷移、增殖、蛋白水解及細(xì)胞分化促進(jìn)因子和抑制因子的共同調(diào)控。最近研究顯示，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族成員之一神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)在體外可促進(jìn)血管EC增殖和遷移，在體內(nèi)可促進(jìn)血管新生；但NGF促血管新生的作用是直接作用，還是通過(guò)增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular end

2、othelial growth factor，VEGF)的分泌而產(chǎn)生的間接作用，仍存在爭(zhēng)議。 血管新生過(guò)程中EC凋亡曾一直被認(rèn)為是與細(xì)胞增殖／生存相抗衡的機(jī)制。然而最近的在體及體外證據(jù)均提示血管EC凋亡不僅與血管退化有關(guān)，而且促進(jìn)整個(gè)脈管系統(tǒng)中多余細(xì)胞的去除并導(dǎo)致管腔形成，但其生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。大多數(shù)血管生成因子在刺激血管EC增殖和遷移的同時(shí)抑制血管EC凋亡。但NGF是誘導(dǎo)還是抑制血管EC凋亡以及NGF是否促進(jìn)管腔形成尚不清楚

3、。 目前認(rèn)為NGF通過(guò)與其兩個(gè)不同的受體：酪氨酸受體激酶A(tyrosine receptor Kinase A，TrkA)及p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。NGF通過(guò)哪一種受體發(fā)揮上述作用有待研究。 研究目的：探討NGF對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial

4、cells，HUVEC)凋亡及其在體外形成管腔樣結(jié)構(gòu)的影響以及相關(guān)受體通路。 實(shí)驗(yàn)方法：NGF對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響采用三維基質(zhì)膠小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生模型，在含不同濃度NGF的無(wú)血清培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)不同天數(shù)后，對(duì)出芽的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色細(xì)胞學(xué)鑒定，或在倒置顯微鏡下觀察、攝像，并以Image Pro圖像分析軟件計(jì)算每高倍視野中平均出芽面積；向培養(yǎng)基中預(yù)先加入抗NGF的中和抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2拮抗劑SU54

5、 16或TrkA受體拮抗劑K252a，觀察NGF對(duì)出芽性血管新生的影響，NGF的促血管新生作用是否依賴于VEGF以及NGF是否通過(guò)TrkA受體促血管新生。HUVEC凋亡通過(guò)活細(xì)胞計(jì)數(shù)，熒光激活的細(xì)胞分選分析膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞百分率以及激活型caspase 3免疫熒光染色測(cè)定。NGF兩種受體TrkA和p75NTR的表達(dá)水平通過(guò)免疫熒光染色及Western Blot進(jìn)行評(píng)價(jià)。以K252a及/或抗p75NTR中和抗體阻斷TrkA及/或p75N

6、TR與NGF的結(jié)合以明確哪一種受體介導(dǎo)NGF誘導(dǎo)的HUVEC凋亡?；|(zhì)膠上管腔樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)在相差顯微鏡下觀察、攝像，并以DAPI，鬼筆環(huán)肽及激活型caspase 3進(jìn)行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察；以Image Pro圖像分析軟件測(cè)量“管腔”面積并用S PSS 11.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)NGF對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響：①外源性NGF(0～100ng/ml)呈濃度依賴性促進(jìn)基質(zhì)膠中培養(yǎng)的

7、小鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽。出芽細(xì)胞CD31的表達(dá)陽(yáng)性?？筃GF的中和抗體能明顯阻斷NGF誘導(dǎo)的出芽性血管新生。②SU5416可顯著減少VEGF誘導(dǎo)的血管新生，但對(duì)NGF誘導(dǎo)的血管新生無(wú)明顯影響。③K252a可明顯抑制NGF誘導(dǎo)的血管新生。(2)NGF對(duì)HUVEC凋亡及其在體外形成管腔樣結(jié)構(gòu)的影響：①管腔樣結(jié)構(gòu)主要由凋亡細(xì)胞組成。②NGF既可誘導(dǎo)HUVEC凋亡又可誘導(dǎo)其在基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)。③抗NGF中和抗體明顯阻斷HUVEC自發(fā)性或由NGF