小鼠髓樣抑制細(xì)胞體外擴(kuò)增及Notch信號分子表達(dá)分析.pdf

1、目的:
　　髓樣抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一群來源于髓樣祖細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞，具有未成熟細(xì)胞的表型和免疫抑制功能。多年來研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路與多種血細(xì)胞的發(fā)育、分化增殖和凋亡密切相關(guān)。本研究的目的是探討體外誘導(dǎo)小鼠MDSC擴(kuò)增的方法及影響因素，并進(jìn)一步分析體外擴(kuò)增的MDSC Notch信號分子的表達(dá)情況，以期為探究MDSC的體外擴(kuò)增機(jī)制及研究MDSC相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)

2、理提供新的思路。
　　方法:
　　(1)探尋MDSC體外擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子濃度。實(shí)驗(yàn)分為五組，分別采用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6、20ng/ml GM-CSF和20ng/mlIL-6、40ng/ml GM-CSF和40ng/ml IL-6、10ng/ml GM-CSF、10ng/mlIL-6刺激2.5×105個/ml的新鮮骨髓細(xì)胞培養(yǎng)4d，流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSC和MDSC亞群(粒細(xì)胞樣MDSC:

3、PMN-MDSC和單核細(xì)胞樣MDSC: MO-MDSC)的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取出MDSC體外擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子濃度。
　　(2)探尋MDSC體外擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)時間。實(shí)驗(yàn)分為兩組，使用10ng/mlGM-CSF和10ng/ml IL-6刺激2.5×105個/ml的新鮮骨髓細(xì)胞分別培養(yǎng)2d和4d，流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取出MDSC

4、體外擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)時間。
　　(3)探尋MDSC體外擴(kuò)增的最佳新鮮骨髓細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)分為三組，使用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6分別刺激1×105個/ml、2.5×105個/ml、5×105個/ml新鮮骨髓細(xì)胞培養(yǎng)4d，流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取出MDSC體外擴(kuò)增的最佳新鮮骨髓細(xì)胞濃度。
　　(4)采用實(shí)時熒光定量PCR和W

5、estern blot檢測體外擴(kuò)增的MDSC Notch信號分子的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)小鼠MDSC體外擴(kuò)增的影響因素有:細(xì)胞因子刺激濃度、培養(yǎng)時間、新鮮骨髓細(xì)胞濃度。
　?、偌?xì)胞因子聯(lián)合刺激組MDSC的比例均顯著高于新鮮骨髓細(xì)胞未刺激組和單獨(dú)GM-CSF或IL-6刺激組（P均＜0.05），但三組之間未見明顯差異。五組不同濃度細(xì)胞因子刺激組PMN-MDSC的比例均顯著低于新鮮骨髓細(xì)胞未刺激組（P均＜0.05），

6、而MO-MDSC的比例則顯著高于新鮮骨髓細(xì)胞未刺激組（P均＜0.05）。提示10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6是最佳細(xì)胞因子濃度組合。
　　②其他培養(yǎng)條件固定時，培養(yǎng)4d的MDSC比例和絕對數(shù)均明顯高于培養(yǎng)2d的比例（P均＜0.05）。但兩組間PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未見明顯差異（P均＞0.05）。提示4d是最佳培養(yǎng)時間。
　?、燮渌囵B(yǎng)條件固定時，骨髓細(xì)胞濃度為2.5×105個/ml組誘導(dǎo)

7、的MDSC比例和絕對數(shù)均顯著高于其他兩個細(xì)胞濃度組（1×105個/ml、2.5×105個/ml）（P均＜0.05）。但三組間PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未見明顯差異（P均＞0.05）。提示2.5×105個/ml是最佳新鮮骨髓細(xì)胞濃度。
　　(2)MDSC體外擴(kuò)增體系中Notch信號相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　與新鮮骨髓細(xì)胞相比，MDSC體外擴(kuò)增體系中Notch信號相關(guān)受體 Notch3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降

8、低（P均＜0.05），而Notch1、Notch2和Notch4表達(dá)水平無明顯差異P均＞0.05）;Notch信號相關(guān)配體Jaggedl mRNA的表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)，Dll1和Dll4的表達(dá)水平則顯著下降（P均＜0.05），而Jagged2的表達(dá)水平未見明顯差異(P＞0.05);Notch信號通路中下游活化靶基因Hes1 mRNA的表達(dá)水平也顯著低于新鮮骨髓細(xì)胞(P＜0.05)，而Hes5和Hey1的表達(dá)水平無明顯差異（