調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞Notch信號(hào)對(duì)哮喘Th1-Th2失衡的影響.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是一種慢性氣道變應(yīng)性疾病，抗原特異性T細(xì)胞的過(guò)度活化在哮喘的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵的樞紐作用。活化的T細(xì)胞分泌過(guò)多的Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等調(diào)控著哮喘的氣道炎癥過(guò)程。過(guò)去一直用“Th1/Th2失衡學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，但哮喘Th1/Th2失衡僅是一個(gè)表象，哮喘患者對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受機(jī)制存在缺陷才是導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞活化、增殖，向Th2細(xì)胞分化，造成Th1/Th2失衡的重要原因。 調(diào)節(jié)性

2、T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是一類(lèi)誘導(dǎo)和維持外周耐受的重要細(xì)胞，但它在哮喘發(fā)病中是否存在極化的不足以及它的免疫調(diào)節(jié)功能是否有缺陷等問(wèn)題都不完全清楚。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)在哮喘發(fā)病中的發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。其生物學(xué)性狀決定了它調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類(lèi)型。Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)分化受到DC的抗原提呈和共刺激信號(hào)的影響。但是DC使初始T細(xì)胞優(yōu)先分化為T(mén)reg細(xì)胞而不是輔助性或記憶性T細(xì)胞的確切機(jī)制尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)，DCNotch1/

3、Serrate1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化。但有關(guān)Notch1/Serrate1信號(hào)通路在哮喘免疫耐受中的作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究觀察了哮喘和用CD25單抗去除CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的小鼠脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量改變、抑制性細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)以及肺部氣道炎癥表現(xiàn)，檢測(cè)了來(lái)源于哮喘和正常的CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌的影響，并將能夠影響Treg細(xì)胞分化的

4、Notch1信號(hào)分子配體Serrate1基因轉(zhuǎn)染至DC，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后DC的表型和在體內(nèi)外對(duì)哮喘CD4+CD25+T細(xì)胞分化的影響，探討了Treg細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用及其極化障礙的分子機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容： 1.FCM檢測(cè)哮喘小鼠BALF中CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量及占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，RT-PCR法檢測(cè)哮喘及去除CD4+CD25+T細(xì)胞再?gòu)?fù)制哮喘模型后CD4+T細(xì)胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA的表達(dá)

5、。 2.分別用相同數(shù)量的來(lái)源于哮喘、正常小鼠的CD4+CD25+T細(xì)胞在體外與哮喘CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖活性，ELISA法檢測(cè)Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子的分泌。 3.應(yīng)用不同劑量rmIL-10霧化處理哮喘小鼠，觀察小鼠肺部炎癥表現(xiàn)，計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)及Eos、淋巴細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ等Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子的含量。 4.RT-PCR法擴(kuò)增小鼠

6、Serrate1全長(zhǎng)序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上。 5.應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將Serrate1表達(dá)載體和篩選載體共轉(zhuǎn)染入DC中，G418篩選。RT-PCR、Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定。 6.FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染后DC表面CD80、CD86、CD11c、CD8α、MHC-Ⅱ等表面分子的表達(dá)，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后DC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響，ELISA法檢測(cè)T細(xì)胞IL

7、-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子的分泌。 7.將超表達(dá)Serrate1的DC與哮喘CD4+T細(xì)胞共同培養(yǎng)后，F(xiàn)CM檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量及占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，ELISA法檢測(cè)上清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β1的含量，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)； 8.將超表達(dá)Serrate1的DC經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)后再常

8、規(guī)復(fù)制哮喘模型，觀察其肺部炎癥表現(xiàn)，F(xiàn)CM檢測(cè)BALF中CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量及占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，RT-PCR法檢測(cè)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ的含量； 結(jié)果： 1.哮喘小鼠體內(nèi)存在明顯的CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量減少，去除CD4+CD25+T細(xì)胞可導(dǎo)致哮喘的抑制性細(xì)胞因子分泌明顯減少，氣道炎癥加重。

9、 2.相同數(shù)量的來(lái)源于哮喘和對(duì)照組小鼠的CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)哮喘Th1、Th2細(xì)胞增殖活化及分泌細(xì)胞因子的作用無(wú)顯著差異，而隨著CD4+CD25+T細(xì)胞的增多，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明哮喘時(shí)主要存在CD4+CD25+T細(xì)胞的極化不足，其功能尚正常，且CD4+CD25+T細(xì)胞的抑制作用呈數(shù)量依賴(lài)性。 3.哮喘小鼠支氣管、肺組織炎癥隨rmIL-10處理劑量的增高而逐漸減輕。與對(duì)照組小鼠相比，哮喘小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)、E

10、os數(shù)均顯著增多，淋巴細(xì)胞亦增多。經(jīng)最低劑量3ngrmIL-10處理后的哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)量較哮喘組明顯減少。經(jīng)3ng、30ng及300ngrmIL-10處理后，BALF中IL-4的含量均較哮喘組明顯減低，IL-5的含量在30ng及300ng處理組顯著減低，3ng處理組IL-5的含量與哮喘組比較無(wú)顯著差異。IFN-γ的含量在3ng處理組即有所增高，但在30ng和300ngrmIL-10處理組卻明顯降低。結(jié)果提示，低劑

11、量的rmIL-10能減低過(guò)敏原激發(fā)后氣道Th2細(xì)胞因子的分泌，隨著rmIL-10劑量的增高，亦能顯現(xiàn)出對(duì)Th1細(xì)胞因子分泌的抑制作用。 4.用RT-PCR法成功擴(kuò)增出小鼠Serratel基因全長(zhǎng)序列，測(cè)序正確，并將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上。轉(zhuǎn)染DC后經(jīng)G418篩選后獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆，RT-PCR、Westernblot法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法證實(shí)Serratel基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SerratelmRNA和蛋白水平均

12、有強(qiáng)烈表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后DC表面CD80、CD86、CD11c、CD40、CD8α及MHC-II等表面分子的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染時(shí)比較無(wú)明顯變化，但轉(zhuǎn)染后DC能抑制T細(xì)胞增殖，T細(xì)胞Th1、Th2類(lèi)細(xì)胞因子的分泌均減少。 6.哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞Notchl分子表達(dá)有所減低，DCSerratel的表達(dá)明顯減低。超表達(dá)Serratel的DC能促進(jìn)哮喘小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+T細(xì)胞的極化，培養(yǎng)上清中IL-2

13、、IL-4、IL-5含量較對(duì)照組明顯減少，IL-10、TGF-β1的含量和CD4+T細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)較對(duì)照組明顯增多。將超表達(dá)Serrate1的DC回輸至小鼠體內(nèi)后可減輕哮喘氣道的炎癥改變，BALF中IL-2、IL-4、IL-5和IFN-含量明顯減低，脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量增多，且脾臟CD4+T細(xì)胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA等表達(dá)明顯增多。 結(jié)論： 1.本文發(fā)現(xiàn)，去除哮喘小鼠體內(nèi)的C

14、D4+CD25+T細(xì)胞能明顯地加重氣道炎癥，而哮喘小鼠模型因CD4+CD25+T細(xì)胞分化障礙而存在數(shù)量減少，提示哮喘體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞的分化和生成減少可能在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有極為重要作用；哮喘體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞的減少可能是對(duì)過(guò)敏原免疫耐受機(jī)制缺陷的重要原因之一。 2.CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的Th2和Th1型免疫應(yīng)答均有顯著的抑制作用，表明CD4+CD25+T細(xì)胞是非選擇性抑制T細(xì)胞活化的重

15、要機(jī)制，在誘導(dǎo)免疫耐受中起重要作用。 3.CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制作用與增加IL-10等抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，是不依賴(lài)與影響Th1/Th2平衡而對(duì)哮喘氣道炎癥進(jìn)行調(diào)控的新的途徑。 4.Serrate1基因轉(zhuǎn)染后的DC可以顯著地抑制T細(xì)胞的增殖活化以及Th2和Th1細(xì)胞因子的分泌，其作用機(jī)制不依賴(lài)于對(duì)DC表面的共刺激分子的影響，而主要通過(guò)Notch1-Serrate1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)完成。 5.超表達(dá)S

16、errate1基因的DC在體內(nèi)外均能促進(jìn)哮喘CD4+CD25+T細(xì)胞的分化，減少活化性Th1、Th2類(lèi)細(xì)胞因子的分泌，增加IL-10等抑制性細(xì)胞因子的分泌，從而顯著的改善哮喘氣道炎癥。結(jié)果提示DC不僅對(duì)T細(xì)胞的活化起重要作用，而且在誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受過(guò)程中也起有十分重要的作用。 臨床意義： Serrate1基因轉(zhuǎn)染后的DC能有效地逆轉(zhuǎn)哮喘小鼠免疫耐受機(jī)制的缺陷，改善哮喘氣道炎癥，提示超表達(dá)Serratel的DC