豬圓環(huán)病毒2型ORF2重組蛋白單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關(guān)疾病的重要病原。PCV2的ORF2基因編碼該病毒結(jié)構(gòu)蛋白，是區(qū)分PCV1和PCV2的重要區(qū)域，具有良好的抗原性。本研究利用已構(gòu)建的基因工程重組菌BL21(DE3)表達(dá)PCV2ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離目的蛋白并切膠純化后作為免疫原免疫8周齡Balb/c小鼠，三次免疫后取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)間接

2、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法篩選，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆3次，最終獲得4株穩(wěn)定分泌抗PCV2ORF2重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為D2A1、H4G2、B10H10和G2G1。經(jīng)ELISA試驗(yàn)檢測，其腹水效價分別達(dá)到1：2.56×106、1：3.2×105、1：3.2×105、1：3.2×105。亞型鑒定4株單克隆抗體均屬IgG2a亞型，其輕鏈均為κ鏈。Westernblot鑒定表明獲得的4株單克隆抗體均能特異性的識別

3、40ku的重組PCV2ORF2蛋白。間接免疫熒光試驗(yàn)表明，單抗D2A1株與PCV2的反應(yīng)為陰性，H4G2、B10H10和G2G1反應(yīng)為陽性，表明后3株單抗能夠識別PCV2ORF2蛋白表位。D2A1和B10H10，D2A1和G2G1，B10H10和G2G1混合檢測時，OD450值比其中任何一種單抗單獨(dú)測定時的OD450值高。由此推測D2A1、B10H10和G2G1是針對不同的抗原表位。PCV2ORF2蛋白單克隆抗體的成功制備為進(jìn)一步研究其