CJ PEB1重組蛋白的表達(dá)及單克隆抗體的制備鑒定.pdf

1、目的:表達(dá)CJ PEB1重組蛋白，制備CJ PEB1蛋白的單克隆抗體及多克隆抗體，為建立血清學(xué)方法檢測CJ感染創(chuàng)造了條件。 方法:1、PEB1重組蛋白的獲得及SDS-PAGE分析<'[1]>．取工程菌E. coli BL21(DE3)培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CJ PEB1重組蛋白。離心收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化，得到高純度的PEB1蛋白溶液，將其轉(zhuǎn)至透析袋中透析并經(jīng)聚乙二醇濃縮后， BCA法進(jìn)

2、行蛋白定量，分裝保存?zhèn)溆?，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。 2、PEB1重組蛋白單克隆抗體的制備及鑒定：以PEB1蛋白溶液與等體積的佐劑完全乳化作為免疫原常規(guī)免疫BALB/C小鼠。待間接ELISA檢測小鼠血清效價滿意后，無菌取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，建立雜交瘤細(xì)胞株。應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測了雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水的抗體效價。Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測抗體特異性。 3、PEB1

3、重組蛋白多克隆抗體的制備及鑒定：以PEB1蛋白溶液與等體積的佐劑完全乳化作為免疫原免疫新西蘭兔，共免疫4次。末次免疫后1W采血測血清效價，再經(jīng)1W心臟采血，收集血清，鹽析法粗提IgG，應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測抗體效價。通過westem-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測抗體特異性。 結(jié)果:1、表達(dá)的蛋白通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預(yù)計(jì)的理論值相符，PEB1重組蛋白純度高。

4、 2、通過間接ELISA法檢測兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水的抗體效價分別為1:8×10<'4>(1D<,7>A<,5>株)和1:5×10<,4>(5G<,2>B<,3>株)，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測效價均為1:8。經(jīng)Western-blot鑒定，兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均與PEB1蛋白特異性地結(jié)合。玻片凝集試驗(yàn)顯示兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水與CJ菌液混合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而與大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等菌菌液混合均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。小鼠單抗分型試

5、劑盒檢測所得兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體的亞型分別為IgG1和IgG3。經(jīng)染色體檢測，兩株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目分別為100±5和97±5。 3、通過間接ELISA法檢測經(jīng)鹽析法粗提的兔IgG抗體的效價為1:2×10<'4>，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測效價為1:8。經(jīng)Western-blot鑒定，經(jīng)鹽析法粗提的兔IgG抗體與PEB 1蛋白特異性地結(jié)合。玻片凝集試驗(yàn)顯示經(jīng)鹽析法粗提的兔IgG抗體與CJ菌液混合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而與大腸桿菌、痢疾

6、桿菌、傷寒桿菌等菌菌液混合均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。 結(jié)論:通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌peblE.coli BL21(DE3)高效表達(dá)基因重組蛋白并經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后獲得高純度的PEB1重組蛋白；以純化的PEB1重組蛋白免疫BALB/C小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)成功建立了2株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，這兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗通過間接ELISA法、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測，所獲得的單抗效價高，