E3泛素連接酶LRSAM1的自締結和活性調控.pdf

1、泛素化是一種重要的蛋白翻譯后修飾形式，它在真核生物的許多生理過程中發(fā)揮重要的調控作用，如蛋白降解，DN A損傷修復，免疫應答，信號傳導，自噬，凋亡等。泛素化過程涉及三種酶，即E1泛素激活酶，E2泛素結合酶和E3泛素連接酶。通過這三種酶的依次級聯(lián)傳遞，最后把泛素分子連接到特異性底物蛋白上。其中E3泛素連接酶在這個過程中起關鍵性的特異性識別作用。
　　目前已知的人類E3泛素連接酶約有600種，它們主要分為三大類：RING型（包括RIN

2、G-like型，如U-Box和 PHD等）、HECT型以及RBR型。主要區(qū)別是RING型 E3調控泛素分子向底物的轉移是直接的，HECT型需先轉移到自身的活性半胱氨酸上，再轉移至底物，是一個間接的過程。RBR型E3含有多個RIN G結構域，轉移泛素機制與HECT型類似。LRSAM1屬于RING-finger型E3泛素連接酶，擁有典型的C3HC4結構。全長LRSAM1擁有723個氨基酸，包含有一個LRR結構域，兩個CC結構域，一個SAM結

3、構域和一個與活性相關的RING結構域。RIN G結構域與其E3活性有關，但是對其它結構域的功能作用知之甚少。并且與其它E3蛋白相比，LRSAM1蛋白的結構，功能，活性調控，定位，信號傳導等有待進一步深入研究。對LRSAM1分子自我活性調控研究是對后期一切功能和結構研究的基礎，但是目前尚未有關LRSAM1蛋白的活性調控的報道。我們制備并純化了LRSAM1的多克隆抗體，對其特異性和效價進行了評估，并用于后期活性調控實驗。隨后從其結構域入手，

4、通過體外泛素化重組實驗和哺乳細胞表達重組實驗，分析了LRSAM1 E3活性調控過程。
　　我們用原核表達系統(tǒng)表達并純化了高純度的不含冗余 tag的全長 LRSAM1蛋白作為抗原，免疫新西蘭大白兔獲得抗體血清。用溴化氰活化的瓊脂糖交聯(lián)LRSAM1抗原蛋白，通過親和層析的方法純化LRSAM1多克隆抗體，對其特異性進行檢測表明其特異性良好，為后期實驗研究奠定了基礎。
　　許多E3連接酶都能形成分子間的寡聚以調控其E3功能或者活性。

5、通過戊二醛交聯(lián)試驗，我們發(fā)現(xiàn) LRSAM1分子間也存在自締結現(xiàn)象。體外實驗中失活的LRSAM1ΔRING可以被野生型 LRSAM1WT識別并泛素化。細胞過表達兩種標簽的LRSAM1，可以通過IP證明LRSAM1的分子間相互作用。
　　為尋找LRSAM1分子間相互作用的最小區(qū)域，通過分子間泛素化實驗，我們發(fā)現(xiàn)LRR和 CC1結構域能被另一 LRSAM1分子泛素化。其中 LRR可被單泛素化而CC1可被多泛素化，LRR結構域含有13個保

6、守的賴氨酸，但是它只發(fā)生了單一的泛素遷移帶，為探明此單泛素化位點，我們構建了LRR的賴氨酸突變體，通過對13個賴氨酸突變體的泛素化情況分析，結果表明賴氨酸不是 LRR結構域的泛素化位點。最終通過兩個獨立的 N H2基團封閉實驗表明 LRR結構域的單泛素化位點發(fā)生在N端的α-N H2上。
　　對構建的LRSAM1氨基端缺失突變體的活性檢測時發(fā)現(xiàn)，其N端串聯(lián)的結構域有明顯增強LRSAM1 E3活性的作用。當LRSAM1只保留其最小活性

7、組件RING-finger結構域時，在相同濃度條件下，RING結構域的活性幾乎檢測不到，當其濃度提高至20倍時檢測到泛素梯度帶。當RING結構域與其N段結構域串聯(lián)，其活性不斷增強，并且LRSAM1ΔLRR和LRSAM1活性相當。
　　體外實驗中除分子間泛素轉移被檢測到外，我們還發(fā)現(xiàn)非活性LRSAM1蛋白的加入極大的減弱了與之重組的 LRSAM1蛋白的活性，但是對野生型和LRSAM1ΔLRR沒有此種作用。為進一步探究是 LRSAM1

8、蛋白的哪一部分結構調控了此種活性的下降，我們進一步構建了單個結構域突變體和多個結構域串聯(lián)突變體，并用它們與含有RING結構域的活性突變體LRSAM1蛋白進行體外泛素化重組實驗，其結果表明SAM或者CC2-SAM結構域的加入能顯著減弱各種LRSAM1突變體的 E3活性，乃至對野生型的 LRSAM1蛋白也有明顯的活性抑制作用。所以我們確定單獨的 CC2-SAM結構有抑制 LRSAM1 E3活性的作用?？紤]到LRSAM1ΔRING對野生型和

9、LRSAM1ΔLRR沒有抑制作用，說明有某種結構能夠拮抗CC2-SAM調控的抑制作用。通過串聯(lián)突變體與 LRSAM1的體外重組實驗，我們發(fā)現(xiàn)與CC2-SAM串聯(lián)的CC1結構域能顯著拮抗掉此種抑制作用，而不是單獨加入的CC1結構域。最后我們在哺乳細胞中過表達底物蛋白TSG101和LRSAM1相關蛋白，研究LRSAM1對于底物的泛素化是否也受到相同的調控，得到了與體外一致的結論。
　　綜上所述，我們通過原核表達系統(tǒng)得到高質量的LRSA

10、M1抗原蛋白，并對其多克隆抗體進行了制備，表明其擁有較好的特異性，并用于后續(xù)活性調控研究。雖然擁有LRR結構域的E3蛋白有一部分因其LRR的存在而自抑制，我們的結果表明，LRR結構域在LRSAM1 E3活性調控中沒有自抑制作用。并且C端的RING-finger結構域與其 N端的結構域串聯(lián)可以增大其 E3活性的功能。LRSAM1分子間通過自締結形成寡聚，這促使了分子間泛素分子的轉移，即LRSAM1蛋白能與自身其它分子相互識別并促使分子間泛