雞痘病毒E3泛素連接酶基因ORF150編碼蛋白與泛素相互作用的初步研究.pdf

1、泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在真核生物細(xì)胞中廣泛存在，參與蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等多種細(xì)胞進(jìn)程。許多病毒也編碼泛素系統(tǒng)中的一些組分，形成了擾亂和操縱宿主細(xì)胞泛素系統(tǒng)的多種機(jī)制。有研究報(bào)道，雞痘病毒(Fowlpox virus，F(xiàn)PV)ORF150編碼一種E3泛素連接酶類似物，屬于N1R/p28基因家族，該家族基因編碼蛋白一般都含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KilA-N)和環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING finger），具有

2、E3泛素連接酶活性。
　　RING型泛素連接酶一般都具有調(diào)控自身泛素化的特點(diǎn)，為研究ORF150編碼蛋白是否也受到自身泛素化的調(diào)控，本研究構(gòu)建了ORF150和Ub的真核表達(dá)載體，通過(guò)免疫共沉淀證明了FPV150蛋白可以發(fā)生泛素化修飾，在LMH細(xì)胞和293T細(xì)胞中進(jìn)行的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FPV150蛋白和Ub共同表達(dá)后亞細(xì)胞定位都發(fā)生了改變，兩者均由散在分布變?yōu)榫奂诩?xì)胞核周圍成團(tuán)分布，且發(fā)生了共定位。
　　為探索FPV

3、 ORF150的基因功能，本研究構(gòu)建了ORF150基因缺失重組病毒。首先利用同源重組和蝕斑純化的方法在雞胚成纖維細(xì)胞(Chick Embryo Fibroblast，CEF)上構(gòu)建和篩選了一株用報(bào)告基因EGFP替換FPV NX10毒株ORF150基因的重組病毒rFPV-△150-EGFP，然后利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了重組病毒rFPV-△150-EGFP中EGFP基因的敲除，得到了不帶篩選標(biāo)記的FPV ORF150基因缺失重組

4、病毒rFPV-△150。取rFPV-△150-EGFP和rFPV-△150的F3代測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示rFPV-△150-EGFP F3和rFPV-△150F3與各自的親本病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)基本一致。將rFPV-△150-EGFP、rFPV-△150和FPV NX10在CEF上連續(xù)傳代，分別通過(guò)熒光觀察、PCR、Western blot和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定鑒定重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。rFPV-△150-EGFP F6代之后隨著病變減少，熒光

5、減少;rFPV-△150在F5代后也出現(xiàn)病變顯著減少的現(xiàn)象，而野生型病毒未見(jiàn)此現(xiàn)象。PCR鑒定和Western blot檢測(cè)的結(jié)果表明重組病毒rFPV-△150-EGFP在傳代過(guò)程中未發(fā)生EGFP基因的丟失，也無(wú)野生型病毒的存在，rFPV-△150在傳代過(guò)程中無(wú)親本病毒或野生型病毒的存在。rFPV-△150-EGFP F5和rFPV-△150F5與野生型病毒FPVNX10的復(fù)制動(dòng)力學(xué)基本一致。
　　利用篩選的重組病毒rFPV-△1

6、50F3代，在CEF細(xì)胞上研究FPV150蛋白與宿主Ub的相互作用。一方面利用熒光定量PCR技術(shù)，分析FPV NX10和rFPV-△150接種細(xì)胞后1～23h（每2h間隔取樣）內(nèi)源性Ub轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果顯示:在大部分觀測(cè)點(diǎn)，接種rFPV-△150組Ub的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平高于FPV NX10組，在3h、7h和21h時(shí)差異顯著(p＜005)，在17h、19h和23h時(shí)差異極顯著(p＜001)，F(xiàn)PV NX10和rFPV-△150分別在感染細(xì)

7、胞后19h和15h引起細(xì)胞的Ub轉(zhuǎn)錄水平大幅升高，說(shuō)明FPV在完成一個(gè)復(fù)制周期之后大量繁殖促進(jìn)Ub轉(zhuǎn)錄。另一方面通過(guò)蝕斑測(cè)定，分析Ub的過(guò)表達(dá)對(duì)FPV NX10和rFPV-△150病毒效價(jià)的影響。結(jié)果表明，在不影響細(xì)胞活性的情況下，Ub的過(guò)表達(dá)能夠使FPV NX10的病毒效價(jià)升高，使rFPV-△150的病毒效價(jià)降低。說(shuō)明FPV150蛋白通過(guò)與Ub相互作用促進(jìn)病毒復(fù)制。
　　本研究對(duì)FPV150蛋白和Ub的相互作用進(jìn)行了初步研究，為