E3泛素連接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、固有免疫應(yīng)答是機(jī)體防御病原入侵的第一道防線。固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)等抗原提呈細(xì)胞通過其表面模式識(shí)別受體（PRRs）檢測(cè)微生物分子成分—病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，PRRs也能夠識(shí)別來源于損傷組織和壞死細(xì)胞的免疫刺激產(chǎn)物，也稱作(DAMPs)。
　　病毒感染時(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，這一過程依賴于免疫細(xì)胞的PRRs對(duì)病毒成分的識(shí)別。TLRs識(shí)別相應(yīng)PAMPs后，能夠活化一系列胞內(nèi)信號(hào)分子，最終導(dǎo)致依賴于

2、核因子κB(NF-κB)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及依賴于干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。維甲酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ樣受體(RLRs)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類RNA解旋酶，主要負(fù)責(zé)dsRNA病毒的識(shí)別。RLRs包括RIG-Ⅰ和MDA5，通過與病毒的相互作用促進(jìn)IRF的活化與核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。水泡口炎病毒(VSV)能夠活化TLRs和RLRs。Ⅰ型干擾素可促進(jìn)200多種抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄，在病毒感染的多個(gè)階段發(fā)揮干預(yù)作用，并且能夠提高

3、細(xì)胞毒NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞的敏感性，抵御病毒感染。
　　泛素化(ubiquitination)是一種普遍存在的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式，可涉及眾多生物學(xué)過程。信號(hào)蛋白的泛素化修飾在固有免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。泛素化是一個(gè)涉及3種酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng):E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶(E3s)。泛素化過程對(duì)底物的特異性識(shí)別主要依賴于E3s。E3s主要分為兩類:HECT E3s和RING E3s。E3s參與免疫應(yīng)答眾多信號(hào)

4、通路的調(diào)節(jié)，例如，E3泛素連接酶RNF125對(duì)RIG-I進(jìn)行K48泛素化修飾介導(dǎo)RIG-Ⅰ在蛋白酶體的降解，負(fù)向調(diào)控RIG-I信號(hào)通路;A20作為一個(gè)去泛素化的E3泛素連接酶，在病毒感染過程中可以靶向調(diào)節(jié)NF-κB和IRF信號(hào)通路。
　　NEDD4L是E3泛素連接酶NEDD4家族成員，屬于HECT E3s。已有報(bào)道NEDD4L能夠泛素化修飾上皮細(xì)胞鈉離子通道，是機(jī)體維持正常血壓的關(guān)鍵調(diào)控者，NEDD4L的突變與高血壓等心血管疾病的

5、發(fā)生密切相關(guān);NEDD4L與許多腫瘤相關(guān):在結(jié)腸癌中，NEDD4L可抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用;NEDD4L可泛素化降解Smad2，負(fù)向調(diào)控TGFβ信號(hào)通路。NEDD4L也涉及到RNA病毒如HIV-1的出芽過程。
　　然而，到目前為止，尚未有NEDD4L在固有免疫應(yīng)答中的相關(guān)報(bào)道。已知NEDD4家族中的NEDD4、ITCH能夠通過不同的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和固有免疫應(yīng)答。NEDD4L作為一個(gè)與NEDD4高度同源，且表達(dá)

6、廣泛的E3泛素連接酶，是否參與抗病毒固有免疫應(yīng)答的調(diào)控尚不清楚。
　　本課題分三部分對(duì)NEDD4L在抗病毒固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控以及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　一、NEDD4L對(duì)VSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的選擇性促進(jìn)作用
　　在C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)VSV感染能夠上調(diào)NEDD4L的表達(dá)水平且具有時(shí)間依賴性。利用靶向干擾NEDD4L的siRNA抑制NEDD4L在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲減能夠

7、抑制VSV誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，而對(duì)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯影響。
　　通過將NEDD4L條件性敲除(CKO)小鼠和Lyz2cre小鼠雜交，培育出NEDD4L髓系基因敲除小鼠（NEDD4Lfl/flLyz2cre+）和同窩野生型對(duì)照小鼠（NEDD4Lfl/flLyz2cre-）。經(jīng)免疫印跡分析NEDD4L的敲除效率，發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NEDD4L的表達(dá)水平降低70％以上，在骨髓巨噬細(xì)胞中NEDD4L表達(dá)量降低80％

8、以上。我們觀察到NEDD4L的缺失不影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，并且經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析了小鼠脾臟、骨髓、外周血中免疫細(xì)胞種類與數(shù)量，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲除并不影響小鼠免疫細(xì)胞的分化發(fā)育。
　　在體外利用VSV感染NEDD4Lfl/flLyz2cre-和NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了VSV誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，而促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯差異。
　　以上研究

9、結(jié)果說明VSV感染時(shí)，NEDD4L能夠促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，但不影響促炎細(xì)胞因子的生成。
　　二、NEDD4L調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究
　　根據(jù)第一部分得到的結(jié)果，我們首先檢測(cè)了NEDD4L對(duì)VSV感染所活化的信號(hào)通路的影響。在不同時(shí)間點(diǎn)利用VSV感染NEDD4Lfl/flLyz2cre-和NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠巨噬細(xì)胞，通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了TBK1和IRF3的活化，但不影

10、響MAPKs中JNK、ERK和P38以及NF-κB中P65的活化，提示NEDD4L作用于TBK1的上游，促進(jìn)下游信號(hào)的活化。
　　我們進(jìn)一步研究了NEDD4L作用的分子機(jī)制。在病毒感染激活的信號(hào)通路中，泛素連接酶TRAF3位于TBK1的上游，可發(fā)生泛素化修飾調(diào)控RLRs、TLRs信號(hào)，是調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。通過分析NEDD4L的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)NEDD4L具有多個(gè)TRAF結(jié)合位點(diǎn)。因此我們猜測(cè)，NEDD4L或許是通過與

11、TRAF3相互作用促進(jìn)了下游信號(hào)分子TBK1和IRF3的活化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們利用VSV感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以激活NEDD4L參與的信號(hào)通路，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定NEDD4L能夠與TRAF3相互結(jié)合。
　　為了進(jìn)一步尋找NEDD4L與TRAF3相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，我們根據(jù)NEDD4L分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建了其不同結(jié)構(gòu)域缺失的突變體:分別為N．末端C2結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD4L-δC2)，C-末端HECT結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD

12、4L-δHECT)，C2及WW結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD4L-δCW)以及位于HECT結(jié)構(gòu)域中的943位半胱氨酸殘基突變體(NEDD4L-C943A)。我們將NEDD4L及其不同突變體的表達(dá)質(zhì)粒與TRAF3共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞，經(jīng)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)C2及WW結(jié)構(gòu)域的缺失(NEDD4L-δCW)會(huì)阻礙NEDD4L與TRAF3的結(jié)合，而C2結(jié)構(gòu)域的缺失(NEDD4L-δC2)并不影響其與TRAF3的結(jié)合，說明WW結(jié)構(gòu)域是二者相互結(jié)合的必要

13、結(jié)構(gòu)域。
　　我們繼而檢測(cè)了二者的相互作用方式。NEDD4L作為E3泛素連接酶，能夠特異性識(shí)別底物并對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾發(fā)揮功能。TRAF3能夠發(fā)生泛素化修飾參與信號(hào)強(qiáng)弱的調(diào)控。因此，我們首先檢測(cè)了NEDD4L對(duì)TRAF3泛素化水平的影響。我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染NEDD4L、TRAF3和泛素(Ubiquitin，Ub)的表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)NEDD4L可明顯促進(jìn)TRAF3的泛素化。我們進(jìn)一步尋找了NEDD4L對(duì)TRAF3泛素化修

14、飾的必要功能域，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HECT結(jié)構(gòu)域缺失(NEDD4L-δHECT)顯著抑制了NEDD4L對(duì)TRAF3的泛素化，說明NEDD4L是通過HECT結(jié)構(gòu)域泛素化修飾TRAF3。C2結(jié)構(gòu)域缺失(NEDD4L-δC2)顯著促進(jìn)了TRAF3的泛素化，提示C2結(jié)構(gòu)域在功能上屬于自我抑制基序。隨后，我們利用Ub及其K63、K48、K29、K11位賴氨酸殘基突變的質(zhì)粒與TRAF3、NEDD4L共轉(zhuǎn)染，以明確NEDD4L對(duì)TRAF3的泛素

15、化方式，發(fā)現(xiàn)K29賴氨酸殘基突變體(Ub-K29R)顯著抑制了NEDD4L對(duì)TARF3的泛素化，說明NEDD4L對(duì)TRAF3的修飾為K29泛素化修飾。
　　第二部分結(jié)果說明，NEDD4L通過其WW結(jié)構(gòu)域與TRAF3相互結(jié)合，通過HECT結(jié)構(gòu)域?qū)RAF3進(jìn)行K29泛素化修飾，增強(qiáng)了下游信號(hào)分子IRF3的活化，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，并且，C2結(jié)構(gòu)域在功能上屬于自我抑制基序。
　　三、NEDD4L在體內(nèi)通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抵

16、御病毒感染
　　我們進(jìn)一步探討了NEDD4L在病毒感染性疾病中的作用，我們通過腹腔注射VSV建立VSV感染的動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠血清中的IFN-β的水平顯著低于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。
　　然后，我們檢測(cè)了VSV感染小鼠肝臟、脾臟中VSV的復(fù)制水平。數(shù)據(jù)顯示NEDD4 Lfl/flLyz2cre+小鼠脾臟和肝臟中VSV RNA擴(kuò)增水平以及組織研磨液中VSVTCID50顯

17、著高于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。提示NEDD4L在體內(nèi)能夠抑制病毒在組織中的復(fù)制。
　　結(jié)果說明，VSV感染小鼠時(shí)，NEDD4L在體內(nèi)通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抑制了VSV在組織細(xì)胞中的增殖，提高了小鼠的抗病毒能力。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中，NEDD4L能夠促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生;明確了NEDD4L依賴其WW結(jié)構(gòu)域直接與TRAF3相互結(jié)合，通過其HECT結(jié)構(gòu)域?qū)RAF3進(jìn)行K29泛素化