E3泛素連接酶Siah-1調(diào)控乙肝病毒X蛋白穩(wěn)定性的分子機制研究.pdf

1、肝癌(HCC)是一類常見的惡性腫瘤。在我國等肝癌高發(fā)區(qū)，乙型肝炎病毒HBV的感染是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要危險因素。HBV編碼的X蛋白(HBx)是一個多功能原癌蛋白，具有廣泛的反式激活作用，可以調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制和感染、影響細胞內(nèi)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)、使宿主基因異常表達、引起細胞惡性增殖和轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。過表達HBx的轉(zhuǎn)基因鼠容易在肝臟中產(chǎn)生自發(fā)性腫瘤，而降低HBx表達能夠抑制由接種Hep3B細胞產(chǎn)生的裸鼠異植瘤的生長。曾有研究表明:HBx

2、的蛋白水平在宿主細胞中是受調(diào)控的，HBx蛋白能夠被泛素化修飾，可以通過蛋白酶體途徑降解，但是能夠調(diào)節(jié)HBx泛素化的E3泛素連接酶還未見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶Siah-1能夠介導(dǎo)HBx蛋白在細胞中通過泛素-蛋白酶體途徑降解。
　　腫瘤抑制因子p53被報道能促進HBx的泛素化，但p53本身并不是E3泛素連接酶，因此我們推測，在受p53調(diào)控表達的眾多E3泛素連接酶中，存在著能夠?qū)Bx泛素化修飾發(fā)揮作用的E3泛素連接酶。很

3、多研究表明，p53能夠誘導(dǎo)E3泛素連接酶Siah-1的表達。Siah-1在肝癌組織中下調(diào)表達，與肝癌惡性程度相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，Siah-1可以促進卡布氏肉瘤病毒(KSHV)編碼的ORF45蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解。因此我們對Siah-1是否影響HBx的泛素化降解展開了研究。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn):在細胞中，過表達Siah-1能夠有效的降低HBx蛋白水平，這一過程依賴于Siah-1的E3泛素連接酶活性，并且這種降解作用能夠被蛋

4、白酶體抑制劑MG132阻斷，siRNA削減內(nèi)源Siah-1的表達能夠上調(diào)HBx的蛋白水平。Siah-1能夠顯著的縮短HBx蛋白的半衰期。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果表明，Siah-1能夠有效的抑制HBx對GRE、HSE和CRE細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄激活作用，這些信號通路與細胞遷移和細胞惡性增殖有關(guān)。細胞內(nèi)Co-IP和體外GSTPullDown的實驗結(jié)果顯示:Siah-1能夠與HBx蛋白互作。細胞內(nèi)免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn)，Siah-1與HBx

5、蛋白可以共定位在細胞質(zhì)的核膜周圍。鑒定Siah-1與HBx蛋白結(jié)合的區(qū)域主要依賴于Siah-1中部的半胱氨酸富集區(qū)和HBx的中部及C-端結(jié)構(gòu)域。體內(nèi)泛素化的實驗結(jié)果表明，Siah-1能夠促進HBx蛋白的多聚泛素化修飾，并且這種作用依賴于Siah-1的E3泛素連接酶活性。已有研究報道，HBx可以通過與20S蛋白酶體亞基C8蛋白的結(jié)合，而被20S蛋白酶體降解。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，Siah-1能夠促進HBx與20S蛋白酶體亞基C8蛋白的結(jié)合，這

6、可能與Siah-1對HBx的泛素化修飾有關(guān)。上述結(jié)果說明E3泛素連接酶Siah-1能夠促進HBx蛋白的泛素化修飾，并介導(dǎo)HBx通過蛋白酶體途降解。由于在肝癌組織中整合的HBx基因存在高頻的C-端缺失現(xiàn)象，有些HBx突變體穩(wěn)定性提高，具有更強的致癌潛能。我們構(gòu)建了三種在肝癌中高頻出現(xiàn)的HBx蛋白C-端缺失突變體，發(fā)現(xiàn)Siah-1不能對這些HBx突變體發(fā)揮降解作用，這可能是導(dǎo)致此類HBx突變體在肝癌組織中穩(wěn)定性提高的原因之一。我們在肝癌細胞

7、中證實了p53能夠促進細胞內(nèi)Siah-1的表達。同時也發(fā)現(xiàn)，當Siah-1的表達被削減時，p53下調(diào)HBx的作用也有所逆轉(zhuǎn)，這說明Siah-1參與了由p53調(diào)控的HBx降解過程。另外，我們的研究還在39對肝癌樣本中，檢測了Siah-1蛋白在癌和癌旁組織中的表達差異，證實了Siah-1的蛋白水平在肝癌組織中下調(diào)。同時，我們在270例肝癌組織樣本和9種肝癌細胞株的DNA中，對Siah-1基因的編碼區(qū)進行了突變篩查，在更大規(guī)模的樣本中證實了S