Ufd1增強(qiáng)泛素連接酶gp78活性的研究.pdf

1、膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量最豐富的甾醇分子，其主要功能是調(diào)節(jié)質(zhì)膜的流動(dòng)性和相變。正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞中的膽固醇濃度被維持在比較穩(wěn)定的水平。膽固醇水平過高經(jīng)常會(huì)引發(fā)多種疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、膽結(jié)石、冠心病等。因此，生物體為維持其正常的生命活動(dòng)而發(fā)展出一套精細(xì)的調(diào)控機(jī)制以維持膽固醇的代謝平衡。膽固醇的起始性合成途徑是其代謝的重要組成，該途徑受細(xì)胞中膽固醇的負(fù)反饋調(diào)控。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)催化HMGCoA生成甲羥

2、戊酸(Mevalonate)，是膽固醇合成途徑中關(guān)鍵的限速步驟，它在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平受甾醇的負(fù)反饋調(diào)控，其中甾醇促進(jìn)的HMGCR的蛋白酶體降解是膽固醇合成途徑關(guān)鍵的反饋調(diào)控步驟。前期研究發(fā)現(xiàn)，gp78是HMGCR降解過程中特異的泛素連接酶，它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Insig形成復(fù)合物。膽固醇合成前體分子羊毛脂固醇(Lanosterol)能夠直接促進(jìn)HMGCR與Insig-gp78相結(jié)合，從而gp78催化HMGCR泛素化，然后HMGCR通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相

3、關(guān)蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)途徑被迅速降解。為深入探索gp78介導(dǎo)的HMGCR蛋白降解的分子機(jī)制，我們采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)Ufd1是gp78的結(jié)合蛋白，并用免疫共沉淀鑒定了它們的結(jié)合位點(diǎn)，體外GST Pull-down實(shí)驗(yàn)證明二者直接相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ufd1通過直接結(jié)合gp78而增強(qiáng)后者的泛素連接酶活性，加速HMGCR的泛素化修飾和蛋白降解。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)U