HECT類泛素連接酶Smurf1自身調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin Proteasome System,UPS)在很多生物過程中占有重要的作用,比如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)激、蛋白質(zhì)降解等等。一般來說,蛋白質(zhì)泛素化由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3通過一系列的酶促級聯(lián)反應(yīng)完成的。E3結(jié)合底物和E2,因此在整個蛋白質(zhì)的降解過程中E3發(fā)揮了至關(guān)重要的選擇性作用,決定了反應(yīng)的特異性。按其結(jié)構(gòu)特點,E3可以分為兩類:HECT(homologous to E

2、6AP C-terminus)結(jié)構(gòu)域家族和RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域家族。在人類發(fā)現(xiàn)的E3s中,RING結(jié)構(gòu)域家族占了95％,而少量的 HECT結(jié)構(gòu)域家族也越來越被人們所了解。人們研究的最多的主要是HECT類E3中Nedd4家族(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene4)。
　　Smurf1(

3、Smad ubiquitin regulatory factor1)是HECT類泛素類連接酶Nedd4家族的一員,含有N端的C2結(jié)構(gòu)域,中間的WW結(jié)構(gòu)域,和C端的HECT結(jié)構(gòu)域。在C2C12細(xì)胞里過表達(dá)Smurf1能阻止BMP蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,引發(fā)成骨的累積;同時還發(fā)現(xiàn)Smurf1能泛素化降解Smad5促進(jìn)肌細(xì)胞的分化。Smurf1小鼠的表型分析表明Smurf1可以通過降解激活的磷酸化形式的MEKK2來抑制動物的骨形成,而且這種抑制作用

4、是隨年齡增加而更加明顯。Smurf1通過泛素化降解Rho的降解來調(diào)控細(xì)胞極性和細(xì)胞前突的形成。這些功能都說明Smurf1在細(xì)胞代謝和腫瘤的調(diào)控都占重要的作用。
　　目前對于Smurfs的研究主要集中在生理功能方面,而對于其自身的泛素連接酶活性的調(diào)控機(jī)制目前研究的還很少。實驗室發(fā)現(xiàn)調(diào)控分子CKIP-1能增強(qiáng)Smurf1與底物分子的親和力的同時也可以增強(qiáng)Smurf1的自身泛素化。但Smurf1的自身泛素化降解是如何發(fā)生的還不完全清楚。

5、
　　首先通過在HEK293T細(xì)胞中Myc-Smurf1-WT和Flag-Smurf1-CA共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)Myc-Smurf1-WT能降低Flag-Smurf1-CA的蛋白表達(dá)水平。Smurf1-CA即699位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?喪失E3活性。Myc-Smurf1-CA不能降低Flag-Smurf1-CA蛋白表達(dá)水平。由此可見,Smurf1自身降解作用是依賴其泛素連接酶活性的。進(jìn)一步通過泛素化實驗,證明了Smurf1蛋白表達(dá)水平

6、降低是通過依賴Smurf1的E3活性的泛素化途徑實現(xiàn)的。通過半衰期實驗發(fā)現(xiàn)Smurf1-WT能縮短Smurf1蛋白的半衰期,更加證明了Smurf1蛋白受到自身的影響。通過免疫共沉淀實驗、過表達(dá)實驗、MG132的阻斷實驗,確定Smurf1的降解區(qū)域是由WW和C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo),其降解能力可被蛋白酶體抑制劑所阻斷。有研究報道如果Smurf1缺失C2結(jié)構(gòu)域仍然能泛素化降解Smad7但是不能泛素化降解Smad1。本文研究了C2結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟murf1