GATA6在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制.pdf

1、一、研究背景
　　膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一種高致死率的消化道惡性實體腫瘤,侵襲轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因。手術(shù)切除能明顯延長膽管癌病人的生存期,然而很多病人在就診時即已發(fā)生微轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移,使手術(shù)無法達到根治的效果;而且很多完成手術(shù)的病人在術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā);這些均嚴(yán)重制約手術(shù)效果和病人預(yù)后。因此,研究膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制,為臨床膽管癌病人的治療和預(yù)后分析提供適宜靶點十分必要。
　　

2、GATA6是進化保守的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,其在胚胎發(fā)育過程中主要參與細胞增殖和分化的調(diào)控。GATA家族包括六個分子:GATA1/2/3主要表達于造血系統(tǒng)細胞,GATA4/5/6主要表達于中胚層和內(nèi)胚層來源的組織,如心臟、消化道上皮、肝臟和肺等。近期研究報道GATA6在惡性實體瘤中表達發(fā)生明顯改變,在腫瘤演進中發(fā)揮重要調(diào)控作用。而且,GATA6在不同組織來源的惡性腫瘤中表達變化情況和生物學(xué)作用明顯不同。在腦星形細胞瘤、卵巢癌和腎上

3、腺皮質(zhì)腫瘤中GATA6表達明顯降低,抑制腫瘤增殖,被認為是腫瘤抑制因子;相反,GATA6在胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中的表達異常增高,促進細胞侵襲,是一個潛在的癌基因。有些學(xué)者將“GATA6這種在不同組織來源的惡性腫瘤中表達變化及作用明顯不同”的模式解釋為“組織來源特異性”。到目前為止,GATA6在膽管癌中表達模式目前未見報道。我們前期體外實驗發(fā)現(xiàn):膽管癌細胞QBC939中GATA6的mRNA表達顯著高于原代膽管上皮細胞,提示:膽管癌中GA

4、TA6表達增加。然而這一結(jié)果需要進一步研究證實。而且,GATA6表達增加在膽管癌中的作用未知。
　　文獻報道GATA6能增強一些消化道上皮特異性基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而調(diào)控其表達。67kDa層粘素受體(67kDalamininreceptor,67LR)是一種非整合素受體,表達于消化道上皮細胞表面,主要介導(dǎo)細胞與基底膜及細胞外基質(zhì)的粘附。研究表達多種腫瘤中67LR表達增高,通過多種機制促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)膽管癌中67L

5、R過表達,顯著促進癌細胞侵襲。惡性腫瘤中67LR過表達受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的機制調(diào)控;在轉(zhuǎn)錄水平,研究報道一些轉(zhuǎn)錄因子能與67LR啟動子結(jié)合,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn):QBC939細胞中67LR高表達亞群同時高表達GATA6;采用生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn):67LR基因啟動子區(qū)存在GATA6的結(jié)合位點。因此,我們推測:GATA6可能與67LR啟動子結(jié)合,調(diào)控67LR過表達。而GATA6可能通過調(diào)控67LR從而影響膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

6、>　　二、研究假說
　　綜合既往研究報道和前期實驗結(jié)果,我們提出以下研究假說:膽管癌中GATA6表達異常改變,與67LR啟動子結(jié)合,上調(diào)67LR表達,從而促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究旨在闡明GATA6在膽管癌中的作用及相關(guān)機制,拓寬膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究,為臨床膽管癌靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　三、材料方法
　　1.收集本科室2005-2010年間行腫瘤切除術(shù)的87例膽管癌病人的組織標(biāo)本,采用免疫組化實驗,對比癌組織和

7、癌旁組織中GATA6表達差異;分析GATA6表達與病人臨床病理特征的相關(guān)性;收集87例膽管癌病人的23例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和8例肝轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本,對比轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中GATA6的表達差異。
　　2.收集87例膽管癌病人的隨訪資料(包括術(shù)后存活時間和無瘤存活時間),采用Kaplan-Meier及Cox模型,分析GATA6表達與病人預(yù)后的關(guān)系。
　　3.構(gòu)建GATA6干擾和過表達載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細胞(QBC939和RBE),干預(yù)GATA6

8、表達;通過損傷修復(fù)實驗、Transwell侵襲實驗及裸鼠脾種植轉(zhuǎn)移模型,研究干預(yù)GATA6對膽管癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67LR的表達情況,分析67LR和GATA6表達的相關(guān)性。構(gòu)建GATA6干擾和過表達載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細胞(QBC939和RBE);通過real-timePCR、western-blot和流式檢測實驗,研究膽管癌細胞中干預(yù)GATA6表達對67LR表達的影響;采用

9、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗,研究膽管癌細胞中GATA6能否與67LR基因啟動子結(jié)合。
　　四、研究結(jié)果
　　1.87例膽管癌組織中,39例癌組織(45％)呈現(xiàn)GATA6核染色陽性;而24例癌旁組織均GATA6核染色陰性;提示膽管癌中存在GATA6異常表達。分析GATA6表達與病人臨床病理特性相關(guān)性提示:GATA6陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),而與病人性別、年齡、組織分化程度、原發(fā)灶T分級和遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)。32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

10、灶中,23例(72%)呈現(xiàn)GATA6核染色陽性,陽性率顯著高于原發(fā)灶(45%);8例肝轉(zhuǎn)移灶中,5例(63%)呈GATA6核染色陽性,其陽性率也高于原發(fā)灶;這些結(jié)果提示:膽管癌中GATA6異常表達與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.Kaplan-Meier分析提示:GATA6陽性表達的病人術(shù)后總存活時間顯著低于GATA6陰性組病人(log-rankp=0.002);而其腫瘤復(fù)發(fā)顯著早于GATA6陰性表達的病人(log-rankp=0.0

11、02)。Cox模型分析提示:GATA6異常表達是判斷病人術(shù)后存活時間和復(fù)發(fā)的相對獨立危險因素(HR=2.015,95%CI=1.188-3.418,p=0.01;HR=2.132,95%CI=1.271-3.576,p=0.004)。本部分結(jié)果提示:GATA6異常表達可能是判斷膽管癌病人預(yù)后的潛在分子標(biāo)志。
　　3.QBC939細胞中GATA6的mRNA和核蛋白表達水平顯著高于RBE細胞。QBC939細胞中,干擾GATA6表達顯著

12、抑制癌細胞的侵襲和遷移能力。RBE細胞中,過表達GATA6表達明顯增強癌細胞的侵襲和遷移能力。動物實驗發(fā)現(xiàn):干擾GATA6表達顯著抑制QBC939細胞的遠處轉(zhuǎn)移能力。本部分實驗提示:GATA6明顯促進膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.87例膽管癌組織中,35例(40%)呈現(xiàn)67LR膜染色陽性。卡方檢驗提示67LR表達與GATA6顯著相關(guān)。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現(xiàn):67LR和GATA6表達與膽管癌組織的同一部位。QBC939細胞中,干擾GA

13、TA6表達導(dǎo)致67LR的蛋白和mRNA表達顯著降低;RBE細胞中,過表達GATA6表達明顯上調(diào)67LR的蛋白和mRNA表達。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn):QBC939和RBE細胞中67LR的膜表達同樣受67LR調(diào)控。ChIP實驗結(jié)果提示:QBC939和RBE細胞中GATA6與67LR基因啟動子區(qū)結(jié)合。本部分實驗結(jié)果提示膽管癌細胞中GATA6與67LR基因啟動子結(jié)合,調(diào)控其表達。
　　五、研究結(jié)論
　　膽管癌中存在GATA6異常表達,其異