膽囊收縮素在膽管癌神經(jīng)周圍浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、本文從以下四個方面就CCK對膽管癌惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，以及膽管癌神經(jīng)周圍浸潤過程中CCK的作用進(jìn)行了初步研究： 1、培養(yǎng)QBC939膽管癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察、CCK的影響及其脫落細(xì)胞的種植轉(zhuǎn)移特性的研究。結(jié)果顯示：膽管癌細(xì)胞傳代接種后，光鏡下可見細(xì)胞貼壁、生長、分裂，形成圓形或橢圓形巢狀結(jié)構(gòu)；繼續(xù)培養(yǎng)，可見培養(yǎng)液中出現(xiàn)懸浮細(xì)胞并逐漸增多。掃描電鏡下可見，培養(yǎng)細(xì)胞相互接觸后，接觸面的細(xì)小絨毛減少，變?yōu)檩^粗的纖毛樣或“殘

2、枝樣”突起，而位于多個細(xì)胞間的細(xì)胞隨著與其它細(xì)胞及培養(yǎng)面實(shí)際接觸面積的減少，逐漸變圓，最后整個細(xì)胞逐漸脫離培養(yǎng)面，成為脫落細(xì)胞，漂浮于培養(yǎng)液之中，凋亡小體少見。加入CCK8s后，可見細(xì)胞密度、圓形深染細(xì)胞較對照組增多，提示CCK8s能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；掃描電鏡可見，CCK8s組細(xì)胞集落多不規(guī)則，細(xì)胞表面較平滑，絨毛較粗短，細(xì)胞間絨毛較對照組明顯為少。CCK8s對細(xì)胞的形態(tài)變化，以及細(xì)胞間的聯(lián)系的影響，提示其可能會對細(xì)胞的粘附、轉(zhuǎn)移特性具有

3、重要作用。對細(xì)胞在懸浮狀態(tài)保存、接種并計(jì)數(shù)的結(jié)果表明，脫落的膽管癌細(xì)胞并未凋零或死亡，且能夠在懸浮狀態(tài)下仍然保持較長時間的活力，遇到合適的培養(yǎng)面，它可以再次貼附，恢復(fù)原來的形態(tài)，并且分裂增殖。這些結(jié)果提示，在臨床上對于脫落的腫瘤細(xì)胞，重新粘附可能是更為困難的步驟。在體外培養(yǎng)條件下，存在有脫落—漂浮—種植—生長現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能與體內(nèi)腫瘤具有相同的“細(xì)胞脫落—種植轉(zhuǎn)移”機(jī)制。2、膽囊收縮素對人膽管癌細(xì)胞粘附、運(yùn)動及侵襲能力的影響的研究。結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn)：CCK8s能夠呈濃度依賴方式影響QBC939細(xì)胞的粘附、運(yùn)動和侵襲能力，生理濃度的CCK8s即能夠明顯降低QBC939細(xì)胞的粘附、運(yùn)動和侵襲能力；而CCK1及CCK2受體的拮抗劑L18和L60均能夠明顯減弱CCK8s抑制瘤細(xì)胞粘附的作用，提示CCK1及CCK2受體對于QBC939細(xì)胞的粘附均具有重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，外源性的CCK8s與QBC939細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力呈正相關(guān)，L18，L60能夠明顯減弱CCK8s的作用，尤以L

5、60明顯。說明CCK2受體在影響QBC939細(xì)胞的運(yùn)動、侵襲能力方面可能具有較強(qiáng)的作用。 3、膽囊收縮素對人膽管癌細(xì)胞侵襲能力的影響的分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCK8s能夠能夠明顯降低膽管癌細(xì)胞QBC939的E-cadmRNA的表達(dá)，其CT值相差1.72(3.29倍)個循環(huán)。CCK8s還能夠增加MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)，其中MMP-2增加CT值2.04個循環(huán)(4.11倍)，MMP-9增加CT值3.55個循環(huán)(1

6、1.71倍)。WesternBlot結(jié)果表明：CCK8s增加膽管癌細(xì)胞QBC939的E-cad的蛋白表達(dá)以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)，這與定量PCR結(jié)果相一致。提示CCK8s能夠通過降低腫瘤細(xì)胞的粘附，增加膽管癌細(xì)胞降解周圍基質(zhì)的能力，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。對膽管癌細(xì)胞/Matrigel培養(yǎng)后的Masson染色結(jié)果也顯示，腫瘤細(xì)胞周圍可見明顯的基質(zhì)融解環(huán)，顯示膽管癌細(xì)胞能夠通過分泌各種蛋白酶降解人工基質(zhì)。

7、 4、膽囊收縮素對人膽管癌細(xì)胞神經(jīng)周圍浸潤影響的實(shí)驗(yàn)研究。研究結(jié)果顯示，在QBC939細(xì)胞與DRG/神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，QBC939細(xì)胞能夠融解并穿過神經(jīng)突起周圍的基質(zhì)成分，靠近神經(jīng)纖維并貼附其生長，進(jìn)一步癌細(xì)胞可分裂增殖形成包繞神經(jīng)纖維的細(xì)胞團(tuán)，提示QBC939細(xì)胞對神經(jīng)纖維具有親嗜性，QBC939對神經(jīng)纖維的浸潤為一主動的、連續(xù)的過程。研究結(jié)果還顯示，CCK8s加入DRG/神經(jīng)—腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中后，能夠明顯增加腫瘤細(xì)胞對神經(jīng)突

8、起的浸潤，而L18，L60均能夠明顯減弱CCK8s的促進(jìn)效應(yīng)，但二者之間差異不明顯。提示CCK能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)侵襲過程，該作用能夠被其特異的阻斷劑所抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，Matrigel能夠較好的滿足小鼠DRG/神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的要求，該體系較好的復(fù)制了腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞基質(zhì)，浸潤神經(jīng)纖維的過程，能夠直觀的觀察腫瘤細(xì)胞/神經(jīng)纖維的相互作用，為進(jìn)一步深入研究腫瘤細(xì)胞/神經(jīng)相互作用提供了較好的模型。 上述結(jié)果顯示，膽管癌細(xì)胞具有抗脫