趨化因子受體CXCR7在肝內(nèi)膽管癌生長轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma.ICC)是指左右肝管匯合部以上的膽管上皮細(xì)胞起源的惡性腫瘤，其惡性程度高、癥狀隱匿，預(yù)后差。肝內(nèi)膽管癌預(yù)后差的主要原因是該病發(fā)展迅速，容易發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、周圍臟器侵犯、淋巴轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，因此研究肝內(nèi)膽管癌生長轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對(duì)肝內(nèi)膽管癌預(yù)防和治療具有重要意義。近來研究發(fā)現(xiàn)多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CXCR7，高表達(dá)CXCR7的腫瘤細(xì)

2、胞惡性度更高、侵襲力更強(qiáng)，更容易引起轉(zhuǎn)移。
　　目前CXCR7在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)情況和在肝內(nèi)膽管癌的生長轉(zhuǎn)移過程中所起的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本課題研究探討CXCR7在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)及其與肝內(nèi)膽管癌臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系；分別采用慢病毒載體上調(diào)CXCR7基因表達(dá)以及shRNA干擾技術(shù)沉默CXCR7基因表達(dá)等方法，研究CXCR7對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的影響；并且在裸鼠皮下及肝臟原位模型上研究CXCR7對(duì)

3、肝內(nèi)膽管癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移的影響，以尋求肝內(nèi)膽管癌治療的可能的新途徑。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 CXCR7在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：本部分研究檢測CXCR7在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)，研究其與CXCR4、CXCL12表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理因素間的關(guān)系及其對(duì)肝內(nèi)膽管癌預(yù)后的影響。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測81例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本及癌旁肝組織標(biāo)本中CXCR7表達(dá)情況，結(jié)合臨床

4、資料進(jìn)行分析，CXCR7表達(dá)陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，CXCR7在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：CXCR7在肝內(nèi)膽管癌組織中高表達(dá)，大部分為胞漿染色，陽性率為66.7％，CXCR7在癌旁正常肝組織中幾乎不表達(dá)（P＜0.01）。CXCR7的表達(dá)與CXCR4、CXCL12的表達(dá)相關(guān)；肝內(nèi)膽管癌臨床病理

5、因素的關(guān)系分析顯示，CXCR7的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期密切相關(guān)，Ⅲ期和Ⅳ期者 CXCR7表達(dá)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CXCR7表達(dá)在低分化肝內(nèi)膽管癌中明顯高于高分化膽管癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CXCR7陽性組1年，3年，5年生存率為46.5%，0%，0%，中位生存時(shí)間為12個(gè)月；CXCR7陰性組1年，3年，5年生存率為88.2%，54%，10.8%，中位生存時(shí)間為48個(gè)月；生存分

6、析表明 CXCR7陽性患者術(shù)后生存期明顯短于CXCR7陰性患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），多因素分析表明CXCR7表達(dá)水平是影響肝內(nèi)膽管癌患者手術(shù)后生存的獨(dú)立因素。
　　第二部分 人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株CXCR7基因的表達(dá)，及CXCR7高/低表達(dá)株的構(gòu)建
　　目的：檢測肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株CXCR7的表達(dá)；構(gòu)建高表達(dá)CXCR7的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株；沉默高表達(dá)CXCR7的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株的基因表達(dá)，為后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究CXC

7、R7基因?qū)Ω蝺?nèi)膽管癌細(xì)胞產(chǎn)生的影響提供基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用Real Time-PCR，Western-blot檢測人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞RBE和HCCC的CXCR7mRNA及其蛋白的表達(dá)。通過構(gòu)建慢病毒CXCR7表達(dá)載體，上調(diào)低表達(dá)CXCR7的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株CXCR7的表達(dá)；再通過慢病毒shRNA載體靶向干擾沉默高表達(dá)CXCR7的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株CXCR7的表達(dá)。
　　結(jié)果：肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株RBE有表達(dá)CXCR7mRNA及蛋白

8、；HCCC表達(dá)CXCR7mRNA量較低，不表達(dá)CXCR7蛋白。慢病毒CXCR7載體感染肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC有效上調(diào)CXCR7 mRNA及其蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。以慢病毒為載體shRNA基因干擾能特異性抑制人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株RBE的CXCR7 mRNA及其蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。
　　第三部分 CXCR7基因?qū)θ烁蝺?nèi)膽管癌細(xì)胞增殖、粘附、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響
　　目的：CXCR7基因?qū)θ烁蝺?nèi)膽管癌細(xì)胞增殖、粘附、

9、侵襲、及轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞 RBE分為三組：RBE、陰性對(duì)照組 RBE-NCshRNA及干擾組RBE-CXCR7shRNA,肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC分為三組：HCCC、陰性對(duì)照組HCCC-LV及上調(diào)組HCCC-CXCR7。應(yīng)用CXCR7的配體CXCL12作用于各組細(xì)胞，CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力；Transwell小室運(yùn)動(dòng)侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力；檢測各組細(xì)胞的黏附能力；明膠酶譜法檢測各組細(xì)胞MM

10、P2分泌。CXCR7小分子抑制劑CCX733與各組細(xì)胞孵育，再分別檢測各組細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果：CXCL12刺激增強(qiáng)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞RBE增殖能力，對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC增殖能力沒有影響，上調(diào)CXCR7表達(dá)可增強(qiáng)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC的增殖能力（P＜0.01）。CXCL12/CXCR7增強(qiáng)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞RBE細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)、侵襲、粘附和分泌MMP2能力（P＜0.01），這些功能在shRNA干擾沉默 CXCR7基因后明顯受到抑制

11、（P＜0.01），CXCR7小分子抑制劑CCX733也抑制這些細(xì)胞功能（P＜0.01）；上調(diào)CXCR7表達(dá)增強(qiáng)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC的遷移運(yùn)動(dòng)、侵襲、粘附和分泌MMP2能力（P＜0.01）。
　　第四部分 CXCR7基因?qū)θ烁蝺?nèi)膽管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長轉(zhuǎn)移能力的影響
　　目的：了解CXCR7基因?qū)θ烁蝺?nèi)膽管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：建立裸鼠皮下肝內(nèi)膽管癌模型，15只裸鼠，隨機(jī)分為3組，每組5只，

12、分別將對(duì)數(shù)生長期 HCCC細(xì)胞，陰性對(duì)照細(xì)胞株 HCCC和上調(diào)組HCCC-CXCR7細(xì)胞株，注入實(shí)驗(yàn)裸鼠右前腋皮下。觀察4w，每周兩次測量腫瘤體積，繪制生長曲線，4w解剖腫瘤，測量體積稱重，病理切片檢查，免疫組化檢測CXCR7的表達(dá)。建立裸鼠肝臟原位肝內(nèi)膽管癌模型，裸鼠15只，隨機(jī)分為3組，每組5只，裸鼠麻醉開腹后將分別將對(duì)數(shù)生長期HCCC、HCCC-CXCR7和HCCC-LV細(xì)胞注入左肝，術(shù)后28d后處死裸鼠，觀察腹水以及肝臟及腹腔轉(zhuǎn)

13、移情況，切取原位癌，稱重后，標(biāo)本病理檢查和免疫組化檢測。
　　結(jié)果：皮下模型CXCR7表達(dá)上調(diào)組（HCCC-CXCR7）細(xì)胞6d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤增長較快，到28d時(shí)已明顯增大，成瘤率為100%；空白對(duì)照組（HCCC）9d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤生長緩慢，成瘤率為80%；陰性對(duì)照組（HCCC-LV）10d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤生長緩慢，成瘤率為80%；根據(jù)腫瘤大小繪制腫瘤生長曲線，HCCC-CXCR7組腫瘤生長速度明顯快于

14、其他兩組(P＜O.01)，其他兩組差別不大(P＞0.05)；腫瘤體積和重量測量結(jié)果顯示，HCCC-CXCR7組明顯大于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜O.01)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無顯著意義(P＞0.05)。原位接種肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC28d后解剖裸鼠，成瘤率為100%；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組可出現(xiàn)腫瘤，腫瘤生長較緩慢，少數(shù)可出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移；CXCR7表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)裸鼠人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞 HCCC-CXCR7原位移植瘤的生長，并且

15、促進(jìn)腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腹腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移(P＜O.01)。
　　結(jié)論：
　　1、肝內(nèi)膽管癌組織中異常高表達(dá)趨化因子受體CXCR7；CXCR7的表達(dá)與CXCR4、CXCL12的表達(dá)相關(guān)；CXCR7的表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌分化、分期、血行轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；CXCR7表達(dá)陽性的肝內(nèi)膽管癌患者術(shù)后生存時(shí)間明顯小于CXCR7陰性患者，CXCR7是影響肝內(nèi)膽管癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　2、肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株R

16、BE表達(dá)CXCR7mRNA及蛋白；肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC表達(dá)CXCR7mRNA量較低，不表達(dá)CXCR7蛋白。以慢病毒為載體CXCR7-LV感染HCCC有效上調(diào)CXCR7 mRNA及其蛋白的表達(dá)。以慢病毒為載體shRNA基因干擾能特異性抑制RBE的CXCR7 mRNA及其蛋白的表達(dá)。
　　3、CXCL12/CXCR7可增強(qiáng)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)、侵襲、粘附和分泌MMP2能力，這些功能在shRNA干擾沉默CXCR7基因后明顯