應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞增殖活性及iNOS表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、舌鱗狀細(xì)胞癌(T0ngue squamous cell carcinoma，TSCC)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占頭頸部腫瘤的40-50﹪，目前主要的治療手段是手術(shù)、放療及化療，但總的治療效果不理想，5年生存率只有60﹪左右，且患者生存質(zhì)量不高。 癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)的過(guò)程，干預(yù)或終止其中某個(gè)或多個(gè)相關(guān)因素或過(guò)程，能夠改變癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，達(dá)到化學(xué)預(yù)防和治療的目的。針對(duì)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子，在基因水平進(jìn)行干預(yù)，

2、是惡性腫瘤的基因治療策略。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β是一類具有多種生物學(xué)效應(yīng)的多肽類細(xì)胞因子超家族，對(duì)機(jī)體許多組織細(xì)胞生長(zhǎng)和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1最為重要，機(jī)體多種細(xì)胞能分泌產(chǎn)生。許多腫瘤組織和細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1，其刺激新血管生成，細(xì)胞遷徙及細(xì)胞外基質(zhì)堆積，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。頭頸部腫瘤中TGF-β1的表達(dá)比正常組織中的表達(dá)要高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較之無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移要高得多。 NO在體內(nèi)起重要的信

3、號(hào)傳到作用，NO與其合成酶-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在腫瘤發(fā)生發(fā)展有很多分子機(jī)制發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤血管生成、抑制細(xì)胞調(diào)亡等。頭頸部腫瘤中iNOS的表達(dá)升高明顯，與TGF-β關(guān)系密切，參與腫瘤新血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)堆積，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是特異性基因表達(dá)沉默的強(qiáng)有力手段之一。 其廣泛存在真核生物中，是生物體在進(jìn)化上的一種保守的基因組水

4、平的免疫監(jiān)控機(jī)制。具有高度特異性、高效率、放大效應(yīng)并可遺傳的特點(diǎn)。因此針對(duì)腫瘤基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)引發(fā)RNAi效應(yīng)，將可能開(kāi)辟腫瘤基因治療的新途徑。本研究以人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞為研究對(duì)象，探討RNA干擾技術(shù)沉默TGF-β1基因后對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖活性及iNOS基因表達(dá)的影響。主要研究方法和結(jié)果有以下幾方面： 1.RNA干擾技術(shù)沉默TGF-β1基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞增殖活性影響。 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-

5、β1基因的siRNA，予以化學(xué)合成，應(yīng)用脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，并設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。用MTT法、免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組細(xì)胞。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，顯示轉(zhuǎn)染特異性TGF-β1基因siRNA片斷后，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制明顯；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示TGF-β1蛋白表達(dá)降低；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默TGF-β1基因后，細(xì)胞凋亡明顯增加。 2．TGF-β1基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞VE

6、GF及iNOS表達(dá)影響Tca8113細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染特異性TGF-β1基因siRNA片斷并設(shè)置陰性對(duì)照組。以RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1基因沉默后VEGF及iNOS基因表達(dá)。結(jié)果顯示基因沉默后TGF-β1、VEGF基因表達(dá)下調(diào)明顯，且iNOS基因表達(dá)也隨之下調(diào)。 結(jié)論 1.舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中TGF-β1高表達(dá)； 2．通過(guò)RNAi可以降低TGF-β1基因的表達(dá)，達(dá)到基因沉默的效果； 3.RNA