基底剛度對(duì)登革病毒2型感染人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、目的:探討細(xì)胞培養(yǎng)基底剛度對(duì)登革病毒感染人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的影響。
　　方法:利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺制備模擬正常人血管內(nèi)皮細(xì)胞基底剛度的水凝膠（0±4Kpa），采用 MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同基底剛度上HUVEC的細(xì)胞周期和凋亡率。常規(guī)方法鑒定增殖登革II型病毒（DENV-2），利用DENV-2（MOI=10）感染人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，透射電鏡觀察接毒組和正常對(duì)照組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，了解登革病毒

2、是否可以引起HUVEC的改變，通過(guò)DAPI染色未發(fā)現(xiàn)明顯的早期凋亡和晚期凋亡。再通過(guò)MTS法比較種植在塑料基底與水凝膠上的HUVEC經(jīng)登革病毒感染后，細(xì)胞增殖率的變化，最后通過(guò)硝酸還原酶法檢測(cè)兩組細(xì)胞釋放NO的水平以及雙抗體夾心 ELISA法檢測(cè) ET-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.利用正常新生兒臍帶可分離培養(yǎng)原代HUVEC，細(xì)胞貼壁呈梭形，排列整齊，呈鵝卵石狀；細(xì)胞表面 CD31分子表達(dá)率為98.14％，胞膜上Ⅷ因子高表

3、達(dá)，符合HUVEC的特點(diǎn)。
　　2.采用自重彎曲法測(cè)得2%雙丙烯酰胺和40%丙烯酰胺配比水凝膠的彈性模量為3030±144Pa。
　　3.登革病毒感染可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變：核仁固縮，線粒體髓樣變，微絨毛消失以及核膜增厚、空泡化明顯。
　　4.內(nèi)皮細(xì)胞增殖率在不同的基底上可出現(xiàn)不同的改變，本研究中發(fā)現(xiàn)在水凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞增殖不如在聚乙烯基底上的明顯。盡管不同基底上HUVEC的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異，但

4、經(jīng)DENV-2感染后釋放的NO水平均較正常未接毒組有所降低，同時(shí)ET-1水平較正常未接毒組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.基底剛度可影響人原代HUVEC的增殖效率，及釋放的NO與ET-1濃度的變化，說(shuō)明血管內(nèi)皮受損后，其分泌合成的血管活性物質(zhì)減少，一定程度上參與了登革熱的致病發(fā)生。
　　2.水凝膠模型表面光滑平整，為了使細(xì)胞更好的粘附其上，采用了IV型膠原蛋白進(jìn)行耦合，制作過(guò)程中加入了APS、TEMED，同