重復(fù)高壓氧預(yù)處理對神經(jīng)元保護作用的機制研究.pdf

1、圍手術(shù)期腦缺血再灌注損傷并不少見且后果極其嚴重，腦中風(fēng)一旦發(fā)生，死亡率高達33％～60％。與心肺等器官相比，針對腦缺血再灌注損傷的治療方法有限且效果不確實。因此，尋找防治腦損傷的有效措施并在臨床上推廣應(yīng)用是圍手術(shù)期腦保護研究亟待解決的重大難題。
　　自Wada1996年發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理可誘導(dǎo)沙土鼠前腦缺血耐受產(chǎn)生之后,學(xué)者們對這一預(yù)處理方法進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)在心臟、肝臟和脊髓，高壓氧同樣可以誘導(dǎo)缺血耐受，減輕缺血再灌注損傷。但其

2、具體機制遠未闡明。我們以往的研究已經(jīng)證實重復(fù)高壓氧預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。其機制包括激活內(nèi)源性抗氧化通路，上調(diào)抗氧化物酶(CAT，SOD)活性，以及增加hemeoxygenase-1(HO-1)轉(zhuǎn)錄及表達。但是以上實驗僅在動物水平研究高壓氧預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷的保護作用，高壓氧預(yù)處理對腦神經(jīng)元是否具有直接的保護作用尚不得而知。為了回答上述問題，并進一步闡明高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機制，本實驗以原代培養(yǎng)的新生鼠皮

3、層神經(jīng)元為對象，采用氧糖剝奪模擬缺血再灌注損傷，研究重復(fù)高壓氧預(yù)處理對皮層神經(jīng)元損傷的保護作用并對其機制進行探討。
　　第一部分重復(fù)高壓氧預(yù)處理對皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷保護作用的研究
　　目的：研究重復(fù)高壓氧預(yù)處理對新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的影響。方法：建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪（OGD）損傷模型。分為空白組（Sham）、對照組（OGD）和高壓氧（HBO）組（0.35MPa，2h，5d）。通過形態(tài)學(xué)觀察、SOD、C

4、AT含量測定、甲基噻唑基四唑比色微量分析（MTT）、細胞凋亡檢測和乳酸脫氫酶（LDH）測定等方法觀察OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷以及重復(fù)高壓氧預(yù)處理對這種損傷的影響。結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至8d左右，神經(jīng)元的突起互相交織成網(wǎng)狀，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明神經(jīng)元已成熟。（2）HBO組高壓氧預(yù)處理5d后24hOGD前神經(jīng)元活力與與SHAM組光密度值無明顯差異。OGD后24h細胞活力下降，OGD組與HBO組和Sham組相比光密度值明顯降低(

5、P<0.05)。（3）流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，在OGD后24h，HBO組和Sham組僅有部分神經(jīng)元發(fā)生凋亡，而OGD組神經(jīng)元凋亡率明顯增多，Sham組、HBO組與OGD組神經(jīng)元凋亡率分別為2.21％、2.69％、4.71％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（4）OGD后24hOGD組與Sham組和HBO組相比，LDH釋放量明顯增多(P<0.05)。（5）在高壓氧預(yù)處理1-5d各個時間點的SOD值三組均無顯著差異；OGD后24h與Sha

6、m組和HBO組相比，OGD組SOD值明顯降低（P<0.05）。隨著高壓氧預(yù)處理的重復(fù)，HBO組CAT含量逐漸升高，Sham組和OGD組CAT含量變化不大。OGD后24h三組CAT均明顯降低，但HBO組仍高于其它兩組（P<0.05）。結(jié)論：氧糖剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，而重復(fù)高壓氧預(yù)處理對這種損傷具有保護作用。
　　第二部分PPARγ信號參與重復(fù)高壓氧處理對皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷保護作用中的機制研究
　　實驗一PPARγ在

7、重復(fù)高壓氧處理對皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪保護作用中的變化研究
　　目的：研究PPARγ信號在重復(fù)高壓氧預(yù)處理對新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷保護作用中的變化研究。方法:建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型，分為空白組（Sham）、對照組（OGD）和高壓氧（HBO）組（0.35MPa，2h，5d）。分別在OGD后2、24、48hour行WesternBlot和RT-PCR方法測定PPARγ蛋白和mRNA表達。結(jié)果：HBO組PPARγ

8、蛋白和mRNA的表達較OGD組和SHAM組明顯增高。通過對OGD后2、24、48h三個時間點的動態(tài)變化觀察顯示，缺血后2h開始有表達，隨時間的推移，其表達逐漸增加，24h達高峰，48h后開始下降。但仍高于OGD組和SHAM組（P<0.05）。結(jié)論：重復(fù)高壓氧預(yù)處理可以使皮層神經(jīng)元PPARγ表達增加，對氧糖剝奪誘導(dǎo)的損傷產(chǎn)生保護。這種保護作用的機制是通過PPARγ表達的上調(diào)實現(xiàn)的。
　　實驗二PPARγ激動劑和拮抗劑對重復(fù)高壓氧處理

9、誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪保護作用的影響
　　目的：研究PPARγ在重復(fù)高壓氧預(yù)處理對抗新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷中的作用以及PPARγ激動劑和拮抗劑對這種保護的影響。方法：建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型，分為空白組（Sham）、氧糖剝奪組（OGD）、高壓氧組（HBO）（0.35MPa，2h）、激動劑組（ACT）和拮抗劑組（IHB）。ACT組末次預(yù)處理24小時后，羅格列酮10μM濃度加入培養(yǎng)基，1h后行2小時OGD，其

10、后更換為正常培養(yǎng)基。IHB組末次預(yù)處理24小時后，GW966210μM濃度加入培養(yǎng)基，30min后行2小時OGD，其后更換為正常培養(yǎng)基。通過甲基噻唑基四唑比色微量分析（MTT）、細胞凋亡和LDH檢測以及RT-PCR和Westernblotting等方法，觀察重復(fù)高壓氧預(yù)處理后，OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷后不同時間點各組PPARγ蛋白和mRNA表達的變化，以及PPARγ激動劑和拮抗劑對這種保護作用的影響。結(jié)果：（1）高壓氧預(yù)處理5天過程中各

11、組光密度值無明顯差異。OGD后24h各組細胞活力下降，OGD組和IHB組與HBO組、Sham組和ACT組相比光密度值明顯降低（P<0.05）。HBO組和ACT組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（2）OGD后24h，OGD組、IHB組、HBO組和Sham組與ACT組相比，LDH釋放量明顯增多(P<0.05)。HBO組和ACT組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（3）OGD后24h，在HBO組、Sham組和ACT組僅有部分神經(jīng)元發(fā)生凋亡，而在OGD組和IHB組神

12、經(jīng)元凋亡率明顯增多，Sham組、OGD組、HBO組、ACT組和IHB組神經(jīng)元凋亡率分別為2.82％、4.71％、3.01％、2.69％、3.47％。OGD組和IHB組與HBO組、Sham組和ACT組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HBO組和ACT組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（4）PPARγ蛋白和mRNA表達：在缺血后2、24h，ACT組明顯高于其它各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。缺血后24h，IHB組明顯低于于其它各組，差異有

13、統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PPARγ激動劑可以促進PPARγmRNA和蛋白表達的增加，對皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷有保護作用；而PPARγ拮抗劑則會逆轉(zhuǎn)這種保護作用。
　　結(jié)論：
　　1、重復(fù)高壓氧預(yù)處理對由氧糖剝奪導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護作用。
　　2、高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元缺血耐受產(chǎn)生的機制部分是通過上調(diào)PPARγ的表達，增強了機體在缺血再灌注過程中清除氧自由基的能力實現(xiàn)的。
　　3、PPARγ激動劑可