SirT1在高壓氧預處理誘導大鼠腦缺血耐受中的作用機制研究.pdf

1、背景：目前治療腦中風的藥物和方法有限且效果不佳，缺血預處理誘導腦缺血耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為腦中風的防治開辟了全新的思路,但由于方法的局限性，缺血預處理很難運用于臨床腦保護。本研究室前期的研究已證實，高壓氧預處理（HBO-PC）能夠誘導腦和脊髓的缺血耐受，可以顯著地模擬缺血預處理的腦保護作用。因其安全、可行，有望成為臨床上預防和減輕腦缺血再灌注損傷的有效方法，并已有研究報道將高壓氧預處理用于臨床預防冠狀動脈搭橋術病人的心肌缺血再灌注損傷。我們以

2、往的研究表明，HBO-PC通過刺激機體產(chǎn)生少量的氧自由基，上調內(nèi)源性抗氧化酶，誘導神經(jīng)保護作用。然而，HBO-PC誘導腦缺血耐受的確切機制仍需進一步研究，臨床上如何合理應用HBO-PC防治腦缺血損傷仍需科學理論依據(jù)。
　　蛋白質的共價修飾包括磷酸化與去磷酸化、乙?；c去乙?；?、甲基化與去甲基化，腺苷化與去腺苷化，以及-S-S-（氧化）與-SH（還原）等，共價修飾可以改變蛋白質的活性。過去的研究多集中在蛋白的磷酸化和去磷酸化作用，但

3、近年來的研究發(fā)現(xiàn)乙?；腿ヒ阴；瘜Φ鞍踪|的功能同樣有著重要的調節(jié)作用。SirT1作為第三類去乙?；福梢曰罨喾N在細胞存活信號通路中起關鍵作用的轉錄因子。尤其在氧化應激狀態(tài)下，SirT1能夠顯著地促進細胞存活。自噬是細胞內(nèi)重要的分解代謝過程，通過自噬途徑可將細胞內(nèi)衰老和損傷的細胞器以及錯誤折疊蛋白分解代謝成可利用的氨基酸，核苷酸等，以維持細胞穩(wěn)態(tài)。有研究表明，SirT1參與了預處理對大鼠海馬切片氧糖剝奪損傷的保護作用，并且自噬活化與缺

4、血預處理誘導的大鼠腦缺血耐受有著密切的關系。此外，另有研究報道SirT1通過去乙酰化自噬相關蛋白，調節(jié)自噬體的形成。
　　基于上述發(fā)現(xiàn)我們推測，HBO-PC通過促進少量氧自由基生成，上調SirT1的表達，活化SirT1下游轉錄因子，誘導自噬途徑，產(chǎn)生腦保護作用。本實驗利用大鼠局灶性腦缺血模型和大鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型，運用體內(nèi)siRNA干涉及體外重組腺病毒轉染技術，對HBO-PC腦保護機制進行了系統(tǒng)地研究。
　　實驗一S

5、irT1在HBO-PC誘導大鼠腦缺血耐受中的作用
　　目的：探討SirT1在HBO-PC腦保護中的作用
　　方法：1）HBO-PC腦缺血半暗帶區(qū)SirT1的表達。選擇成年雄性SD大鼠，采用線栓法右側大腦中動脈阻閉（MCAO）為局灶性腦缺血模型。連續(xù)5天高壓氧預處理（2.5ATA，100％O2，1h·d-1）后24h行MCAO120min，然后再灌注24h。檢測缺血前、再灌注后1、3、6、12、24h時間點SirT1蛋白的表達

6、以及再灌注后3hSirT1的mRNA表達，免疫熒光雙標定位。2）SirT1對HBO-PC腦保護作用的影響。應用SirT1激動劑、抑制劑及SirT1siRNA分別上調和下調SirT1，檢測再灌注后24h大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死容積。SirT1激動劑白藜蘆醇灌胃，50mg·kg-1，1次·d-1，15天；SirT1抑制劑EX527分1、10、30μg三個劑量于HBO-PC前行側腦室注射，連續(xù)5天；側腦室注射SirT1siRNA，5μg，1

7、6μl，注射后1～7天檢測腦組織中SirT1的表達。
　　結果：HBO-PC能夠改善大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學評分，縮小腦梗死容積。與缺血再灌注損傷相比，HBO-PC顯著增加SirT1的蛋白和mRNA表達。從再灌注后3h開始SirT1蛋白表達增加，至少可持續(xù)至24h，且主要是在腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元細胞核中。10μg和30μgEX527能夠逆轉HBO-PC的腦保護作用。相反，白藜蘆醇治療能夠改善其后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷的神

8、經(jīng)行為學評分，縮小腦梗死容積，與HBO-PC的腦保護作用相同。SirT1siRNA抑制HBO-PC誘導的SirT1的增加，消除了HBO-PC的腦保護作用。
　　結論：HBO-PC通過上調SirT1的表達，減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。
　　實驗二SirT1在HBO-PC誘導大腦皮層神經(jīng)元缺血耐受中的作用
　　目的：探討SirT1在HBO-PC神經(jīng)元保護中的作用
　　方法：1）HBO-PC對神經(jīng)元的保護作用。取孕

9、16-18天SD大鼠胚胎的大腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)。培養(yǎng)至第8天行HBO-PC（3.5ATA，氧濃度>90％）處理120min，24h后進行氧糖剝奪（OGD）（95％N2，5％CO2）120min，復氧24h，檢測細胞存活率（MTT）和乳酸脫氫酶（LDH）漏出率。2）SirT1在HBO-PC、氧糖剝奪（OGD）損傷神經(jīng)元中的表達。OGD/復氧（OGD/R）后24h檢測SirT1的蛋白表達。3）SirT1對HBO-PC神經(jīng)元保護作用的影響。

10、采用重組腺病毒體外轉染技術，將攜帶有SirT1基因（Ad-SirT1）和SirT1siRNA（Ad-siRNA-SirT1）的腺病毒轉入神經(jīng)元，上調和下調SirT1的表達。轉染后48h檢測轉染效率及轉染后SirT1的表達。Ad-siRNA-SirT1轉染48h后給予HBO-PC。OGD120min、復氧24h后檢測MTT和LDH漏出率。結果：大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第6天，免疫熒光染色純度鑒定顯示，神經(jīng)元純度>95％。HBO-PC增加神

11、經(jīng)元OGD/R損害后24h細胞存活率，降低LDH漏出率。與OGD損傷相比，復氧后24hHBO-PC增加SirT1的表達。在MOI為10、50、100的條件下，重組腺病毒Ad-SirT1轉染效率依次為30％、88％、95％。Ad-siRNA-SirT1轉染效率依次為20％、60％、80％。
　　Ad-SirT1轉染后48hSirT1蛋白表達顯著增加；Ad-siRNA-SirT1轉染SirT1顯著降低。OGD/R后24h，Ad-Sir

12、T1轉染上調SirT1蛋白表達，細胞存活率增加，LDH漏出率降低。Ad-siRNA-SirT1轉染抑制HBO-PC誘導的SirT1的增加，HBO-PC的神經(jīng)元保護作用消失。
　　結論：HBO-PC通過上調SirT1的表達，減輕體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元的OGD/R損傷。
　　實驗三自噬在HBO-PC誘導大鼠腦缺血耐受中的作用
　　目的：探討自噬在HBO-PC腦保護中的作用
　　方法：1）HBO-PC腦缺血半暗帶區(qū)自噬

13、的表達。選擇成年雄性SD大鼠，給予HBO-PC和MCAO處理。檢測缺血前、再灌注后1、3、6、12、24h時間點自噬相關蛋白LC3-II表達變化以及再灌注后6hBeclin1的表達和自噬體的形成以及免疫熒光雙標定位。2）自噬對HBO-PC腦保護作用的影響。分別應用自噬抑制劑和激動劑抑制和活化自噬，缺血再灌注后6h檢測LC3-II和Beclin1蛋白表達。再灌注后24h檢測神經(jīng)行為學評分和腦梗死容積。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）3

14、0μg于HBO-PC前行側腦室注射，連續(xù)5天；自噬激動劑雷帕霉素，30ng單次側腦室注射，24h后行MCAO。結果：HBO-PC增加LC3-II和Beclin1蛋白表達和自噬體的形成，LC3-II從再灌注后3h開始增加至少可持續(xù)至24h。LC3表達主要是在神經(jīng)元細胞質中。3-MA抑制HBO-PC誘導的LC3-II和Beclin1的上調，逆轉HBO-PC的腦保護作用。雷帕霉素側腦室注射上調LC3-II和Beclin1的表達，減輕其后發(fā)生的