孕酮對Aβ所致神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、關(guān)于孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制仍不完全清楚。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 孕酮對Aβ25-35所致神經(jīng)元損傷的保護作用
　　目的:觀察孕酮對Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護作用，探索孕酮是否可能通過其代謝產(chǎn)物別孕烯醇酮(AP)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　方法:新生1d內(nèi)SD乳鼠，取皮層部位進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后，以βⅢ-Tubulin(TUJ1)神經(jīng)元特異性抗體和Hoechst

2、33258雙染鑒定神經(jīng)元純度。采用Aβ活性片斷Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型。通過MTT或Hoechest33258核染色法測定加入不同濃度孕酮、別孕烯醇酮或非那雄胺作用后神經(jīng)元存活率及凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度鑒定雙染結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞純度＞90％。
　　2.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)元存活率的影響。
　　3.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)元凋亡率的影響。
　　4.5α

3、-還原酶抑制劑非那雄胺對孕酮在AD細(xì)胞模型神經(jīng)保護作用的影響。
　　5.別孕烯醇酮(AP)對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型神經(jīng)元存活率的影響。
　　結(jié)論:
　　1.PROG能濃度和時間依賴地抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率。
　　2.在細(xì)胞模型下，PROG對抗Aβ25-35引起的神經(jīng)元損傷，不是通過其代謝物AP發(fā)揮作用的。
　　第二部分 孕酮通過抑制線粒體凋亡通路減輕A

4、β所致神經(jīng)元損傷
　　目的:觀察孕酮對Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體凋亡通路的保護作用，探討PROG的神經(jīng)保護作用機制。
　　方法:以Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型。以熒光染色技術(shù)檢測孕酮干預(yù)后，線粒體膜電位的變化。應(yīng)用Western-blot技術(shù)，研究孕酮干預(yù)后，Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3表達的變化。
　　結(jié)果:
　　1.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的

5、AD模型神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位的影響
　　熒光倒置顯微鏡下觀察，與溶劑對照組比較，Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組神經(jīng)元細(xì)胞線粒體熒光明顯增加，經(jīng)羅丹明熒光染色法檢測，Aβ處理組的細(xì)胞的線粒體膜電位為溶劑對照組的（65.9±4.5）％(P＜0.01)。與模型組比較，PROG保護組的神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位呈明顯增加趨勢，為溶劑對照組的(81.9±4.7)％(P＜0.01)。
　　2.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型神經(jīng)元胞漿中

6、Bax/Bcl-2比值的影響
　　采用Western-blot檢測，Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組胞漿中Bax/Bcl-2比值約為對照組的8.1倍，顯著高于對照組(P＜0.01)。與模型組比較，PROG共孵育后Bax/Bcl-2表達比值呈顯著降低趨勢，約為模型組的53％(P＜0.01)，其中單加孕酮組(1μM)組胞漿Bax/Bcl-2表達比值與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模

7、型神經(jīng)元胞漿中cleaved-caspase3水平的影響
　　Western-blot檢測顯示，Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組胞漿中cleaved-caspase3表達水平為對照組的4.9倍，顯著高于對照組(P＜0.01)。與模型組比較，PROG共孵育后cleaved-caspase3表達水平呈顯著下降趨勢，約為模型組對照組的47％（P＜0.01）;其中單加孕酮組(1μM)胞漿cleaved-caspase3表達水平與對照組比較無統(tǒng)計

8、學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　PROG對抗Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷時，PROG能抑制線粒體凋亡途徑主要相關(guān)蛋白改變，升高線粒體膜電位，降低cleaved-caspase3表達。表明PROG能通過線粒體凋亡途徑抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)損傷作用。
　　第三部分 孕酮通過PGRMC1減輕Aβ所致神經(jīng)元損傷
　　目的:探索孕酮是否通過classic PR或PGRMC1對Aβ蛋白引起的皮層神經(jīng)元損

9、傷產(chǎn)生保護作用，
　　方法:Western blot法檢測Aβ對神經(jīng)元PGRMC1和classic PR表達的影響;在Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型下，通過MTT、Hoechest33258核染色法測定classicPR抑制劑(RU486)和PGRMC1抑制劑(AG205)對孕酮的抗凋亡作用的影響;應(yīng)用Western-blot技術(shù)，研究PGRMC1的阻斷劑(AG205)對孕酮的線粒體通路保護作用的影響。
　

10、　結(jié)果:
　　1.PGRMC1在神經(jīng)元的胞體和突起都有豐富的表達，有少量PGRMC1在胞核表達。Classic PR主要在胞核表達，有少量存在于胞漿中。
　　2.Aβ25-35處理48 h后，皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)PGRMC1的表達明顯增加。與對照組(Ctrl)相比，Aβ25-35組PGRMC1的相對表達少量增加(P＜0.01)。而Aβ25-35處理組Classic PR與對照組無顯著差異。
　　3.AG205能部分阻斷孕酮的神

11、經(jīng)保護作用，孕酮是通過PGRMC1發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　4.孕酮部分通過PGRMC1調(diào)控線粒體凋亡通路。
　　結(jié)論:
　　1.Aβ上調(diào)皮質(zhì)神經(jīng)元中PGRMC1的表達，但不影響classic PR的表達。
　　2.孕酮部分通過PGRMC1抑制線粒體凋亡通路，進而對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性。
　　第四部分 孕酮通過抑制JNK磷酸化減輕Aβ所致神經(jīng)元損傷
　　目的:研究JNK信號通路在孕酮保護原代培養(yǎng)皮層神

12、經(jīng)元免受Aβ?lián)p傷的機制中的作用。
　　方法:采用Western-blot檢測孕酮或p-JNK抑制劑(SP600125)對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元JNK磷酸化的影響;采用MTT和Hoechst33258核染色法檢測孕酮或p-JNK抑制劑(SP600125)對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元存活率和凋亡率的影響;采用Western-blot法觀察PGRMC1的阻斷劑(AG205)干預(yù)孕酮對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元p-JNK表達水平的影響

13、。
　　結(jié)果:
　　1.PROG可以部分發(fā)揮p-JNK抑制劑的作用，降低Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型神經(jīng)元胞漿中JNK磷酸化表達水平
　　采用Western-blot檢測，與對照組比較，模型組胞漿中p-JNK/JNK表達水平顯著高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，100 nmol·L-1 SP600125預(yù)處理明顯抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的p-JNK表達上升;PROG可以部分發(fā)揮p-JNK抑制劑的作用，明顯抑制A

14、β引起的p-JNK表達水平(P＜0.01)。
　　2.PROG在功能上可以部分模擬p-JNK抑制劑SP600125對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性作用。
　　3.孕酮抑制JNK磷酸化不依賴于PGRMC1
　　第三部分證實孕酮部分通過PGRMC1發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這部分我們想證實是否孕酮抑制JNK磷酸化也依賴于PGRMC1。Western-blot檢測結(jié)果顯示，AG205沒有影響孕酮對JNK磷酸化的抑制作用。這個結(jié)果提示孕酮抑制

15、Aβ誘導(dǎo)的JNK磷酸化獨立于PGRMC1。
　　結(jié)論:
　　1.PROG可以通過抑制JNK磷酸化對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性作用。
　　2.孕酮抑制JNK磷酸化不依賴于PGRMC1。
　　綜上所述，本實驗以Aβ25-35處理原代皮層神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型，使用MTT、Hoechst33258核染色法、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot等方法，研究孕酮對于Aβ25-35神經(jīng)毒性的保護作用及其可能機制。研究發(fā)現(xiàn)孕酮對

16、于Aβ25-35神經(jīng)毒性的保護作用具有濃度和時間依賴性，且在1μM孕酮處理48 h的時候，孕酮的保護作用最為顯著，因此，本實驗采用此濃度和時間來研究孕酮的保護作用機制。研究首先發(fā)現(xiàn)，在本試驗中，孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用不是通過其代謝物AP實現(xiàn)的;進一步發(fā)現(xiàn)孕酮通過緩解Aβ引起的線粒體膜電位降低來保護線粒體功能，并且孕酮能緩解Aβ引起的Bax/Bcl-2和cleaved-caspase3上調(diào)，提示孕酮通過抑制線粒體凋亡通路來緩解Aβ引起的細(xì)胞