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文檔簡介
1、關(guān)于孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制仍不完全清楚。本文主要從以下幾部分展開論述:
第一部分 孕酮對Aβ25-35所致神經(jīng)元損傷的保護作用
目的:觀察孕酮對Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護作用,探索孕酮是否可能通過其代謝產(chǎn)物別孕烯醇酮(AP)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
方法:新生1d內(nèi)SD乳鼠,取皮層部位進行體外培養(yǎng),培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后,以βⅢ-Tubulin(TUJ1)神經(jīng)元特異性抗體和Hoechst
2、33258雙染鑒定神經(jīng)元純度。采用Aβ活性片斷Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型。通過MTT或Hoechest33258核染色法測定加入不同濃度孕酮、別孕烯醇酮或非那雄胺作用后神經(jīng)元存活率及凋亡率。
結(jié)果:
1.原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度鑒定雙染結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞純度>90%。
2.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)元存活率的影響。
3.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)元凋亡率的影響。
4.5α
3、-還原酶抑制劑非那雄胺對孕酮在AD細(xì)胞模型神經(jīng)保護作用的影響。
5.別孕烯醇酮(AP)對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型神經(jīng)元存活率的影響。
結(jié)論:
1.PROG能濃度和時間依賴地抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用,提高細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞凋亡率。
2.在細(xì)胞模型下,PROG對抗Aβ25-35引起的神經(jīng)元損傷,不是通過其代謝物AP發(fā)揮作用的。
第二部分 孕酮通過抑制線粒體凋亡通路減輕A
4、β所致神經(jīng)元損傷
目的:觀察孕酮對Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體凋亡通路的保護作用,探討PROG的神經(jīng)保護作用機制。
方法:以Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型。以熒光染色技術(shù)檢測孕酮干預(yù)后,線粒體膜電位的變化。應(yīng)用Western-blot技術(shù),研究孕酮干預(yù)后,Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3表達的變化。
結(jié)果:
1.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的
5、AD模型神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位的影響
熒光倒置顯微鏡下觀察,與溶劑對照組比較,Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組神經(jīng)元細(xì)胞線粒體熒光明顯增加,經(jīng)羅丹明熒光染色法檢測,Aβ處理組的細(xì)胞的線粒體膜電位為溶劑對照組的(65.9±4.5)%(P<0.01)。與模型組比較,PROG保護組的神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位呈明顯增加趨勢,為溶劑對照組的(81.9±4.7)%(P<0.01)。
2.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型神經(jīng)元胞漿中
6、Bax/Bcl-2比值的影響
采用Western-blot檢測,Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組胞漿中Bax/Bcl-2比值約為對照組的8.1倍,顯著高于對照組(P<0.01)。與模型組比較,PROG共孵育后Bax/Bcl-2表達比值呈顯著降低趨勢,約為模型組的53%(P<0.01),其中單加孕酮組(1μM)組胞漿Bax/Bcl-2表達比值與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
3.PROG對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模
7、型神經(jīng)元胞漿中cleaved-caspase3水平的影響
Western-blot檢測顯示,Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組胞漿中cleaved-caspase3表達水平為對照組的4.9倍,顯著高于對照組(P<0.01)。與模型組比較,PROG共孵育后cleaved-caspase3表達水平呈顯著下降趨勢,約為模型組對照組的47%(P<0.01);其中單加孕酮組(1μM)胞漿cleaved-caspase3表達水平與對照組比較無統(tǒng)計
8、學(xué)差異(P>0.05)。
結(jié)論:
PROG對抗Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷時,PROG能抑制線粒體凋亡途徑主要相關(guān)蛋白改變,升高線粒體膜電位,降低cleaved-caspase3表達。表明PROG能通過線粒體凋亡途徑抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)損傷作用。
第三部分 孕酮通過PGRMC1減輕Aβ所致神經(jīng)元損傷
目的:探索孕酮是否通過classic PR或PGRMC1對Aβ蛋白引起的皮層神經(jīng)元損
9、傷產(chǎn)生保護作用,
方法:Western blot法檢測Aβ對神經(jīng)元PGRMC1和classic PR表達的影響;在Aβ25-35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型下,通過MTT、Hoechest33258核染色法測定classicPR抑制劑(RU486)和PGRMC1抑制劑(AG205)對孕酮的抗凋亡作用的影響;應(yīng)用Western-blot技術(shù),研究PGRMC1的阻斷劑(AG205)對孕酮的線粒體通路保護作用的影響。
10、 結(jié)果:
1.PGRMC1在神經(jīng)元的胞體和突起都有豐富的表達,有少量PGRMC1在胞核表達。Classic PR主要在胞核表達,有少量存在于胞漿中。
2.Aβ25-35處理48 h后,皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)PGRMC1的表達明顯增加。與對照組(Ctrl)相比,Aβ25-35組PGRMC1的相對表達少量增加(P<0.01)。而Aβ25-35處理組Classic PR與對照組無顯著差異。
3.AG205能部分阻斷孕酮的神
11、經(jīng)保護作用,孕酮是通過PGRMC1發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
4.孕酮部分通過PGRMC1調(diào)控線粒體凋亡通路。
結(jié)論:
1.Aβ上調(diào)皮質(zhì)神經(jīng)元中PGRMC1的表達,但不影響classic PR的表達。
2.孕酮部分通過PGRMC1抑制線粒體凋亡通路,進而對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性。
第四部分 孕酮通過抑制JNK磷酸化減輕Aβ所致神經(jīng)元損傷
目的:研究JNK信號通路在孕酮保護原代培養(yǎng)皮層神
12、經(jīng)元免受Aβ?lián)p傷的機制中的作用。
方法:采用Western-blot檢測孕酮或p-JNK抑制劑(SP600125)對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元JNK磷酸化的影響;采用MTT和Hoechst33258核染色法檢測孕酮或p-JNK抑制劑(SP600125)對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元存活率和凋亡率的影響;采用Western-blot法觀察PGRMC1的阻斷劑(AG205)干預(yù)孕酮對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元p-JNK表達水平的影響
13、。
結(jié)果:
1.PROG可以部分發(fā)揮p-JNK抑制劑的作用,降低Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型神經(jīng)元胞漿中JNK磷酸化表達水平
采用Western-blot檢測,與對照組比較,模型組胞漿中p-JNK/JNK表達水平顯著高于對照組(P<0.01);與模型組比較,100 nmol·L-1 SP600125預(yù)處理明顯抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的p-JNK表達上升;PROG可以部分發(fā)揮p-JNK抑制劑的作用,明顯抑制A
14、β引起的p-JNK表達水平(P<0.01)。
2.PROG在功能上可以部分模擬p-JNK抑制劑SP600125對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性作用。
3.孕酮抑制JNK磷酸化不依賴于PGRMC1
第三部分證實孕酮部分通過PGRMC1發(fā)揮神經(jīng)保護作用,這部分我們想證實是否孕酮抑制JNK磷酸化也依賴于PGRMC1。Western-blot檢測結(jié)果顯示,AG205沒有影響孕酮對JNK磷酸化的抑制作用。這個結(jié)果提示孕酮抑制
15、Aβ誘導(dǎo)的JNK磷酸化獨立于PGRMC1。
結(jié)論:
1.PROG可以通過抑制JNK磷酸化對抗Aβ引起的神經(jīng)元毒性作用。
2.孕酮抑制JNK磷酸化不依賴于PGRMC1。
綜上所述,本實驗以Aβ25-35處理原代皮層神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型,使用MTT、Hoechst33258核染色法、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot等方法,研究孕酮對于Aβ25-35神經(jīng)毒性的保護作用及其可能機制。研究發(fā)現(xiàn)孕酮對
16、于Aβ25-35神經(jīng)毒性的保護作用具有濃度和時間依賴性,且在1μM孕酮處理48 h的時候,孕酮的保護作用最為顯著,因此,本實驗采用此濃度和時間來研究孕酮的保護作用機制。研究首先發(fā)現(xiàn),在本試驗中,孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用不是通過其代謝物AP實現(xiàn)的;進一步發(fā)現(xiàn)孕酮通過緩解Aβ引起的線粒體膜電位降低來保護線粒體功能,并且孕酮能緩解Aβ引起的Bax/Bcl-2和cleaved-caspase3上調(diào),提示孕酮通過抑制線粒體凋亡通路來緩解Aβ引起的細(xì)胞
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