傳染性鮭魚貧血癥病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、許多囊膜病毒都能夠編碼基質(zhì)蛋白，包括副粘病毒、正粘病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。病毒的基質(zhì)蛋白也被稱為病毒裝配“適配器”，因?yàn)樗芙閷?dǎo)病毒包膜或糖蛋白與病毒核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物的相互作用，從而促進(jìn)病毒基因組組裝進(jìn)新裝配的病毒中。正粘病毒家族所有的成員，包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒屬，以及Isavirus，都編碼基質(zhì)蛋白，并稱為M1。在A型流感病毒中，基質(zhì)蛋白1(M1)在病毒的囊膜下聚集成一層蛋白層，幫助形成感染

2、病毒的形狀以及維持其結(jié)構(gòu)的完整性。研究表明，流感病毒的M1蛋白能介導(dǎo)核衣殼的核輸出以及隨后將其包裝到新的病毒粒子中，還能夠介導(dǎo)病毒的出芽。盡管對(duì)于A型流感病毒M1蛋白的研究十分廣泛及細(xì)致，但到目前為止，只有其N端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)被解析出來。
　　傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)是一種能夠?qū)е吗B(yǎng)殖的大西洋鮭魚高死亡率的重要的正粘病毒。ISAV和流感在病毒結(jié)構(gòu)、基因組成、生活周期以及病毒編碼的各種蛋白的功能上都有很多相似之處，是研究流

3、感病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的一個(gè)很好的可供選擇的模型。
　　為了從整體上更好地了解正粘病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，本研究解析了ISAV的M1蛋白(ISAV-M1)全長(zhǎng)的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到了2.6(A)。這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道正粘病毒基質(zhì)蛋白的全長(zhǎng)晶體結(jié)構(gòu)。ISAV-M1的晶體結(jié)構(gòu)表明:其含有一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域(N-domain)和C端結(jié)構(gòu)域(C-domam)，整體呈現(xiàn)一個(gè)肘形。雖然ISAV-M1的N-domain與A型流感病毒M1蛋白的N-d

4、omain在序列上相似度很低，但其在結(jié)構(gòu)上卻是相似的。ISAV-M1的C-domain通過一個(gè)延伸的Loop結(jié)構(gòu)與N-domain相連，并且折疊成一個(gè)含有4個(gè)α-螺旋的螺旋束。在晶體中，ISAV-M1的單體組裝成無限的二維晶格，這種結(jié)構(gòu)特征與流感病毒完整的病毒顆粒中與膜相連的基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)類似。通過脂質(zhì)體浮選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ISAV-M1是通過靜電相互作用與膜結(jié)合的，并且找出了關(guān)鍵的膜結(jié)合位點(diǎn)是在N-domain上的K63/K66/K68。同

5、時(shí)也證實(shí)ISAV-M1具有RNA結(jié)合活性。此外，用低溫電子斷層掃面檢測(cè)ISA病毒粒子，發(fā)現(xiàn)ISAV-M1在病毒的包膜下面形成一層蛋白基質(zhì)。將ISAV-M1的二維晶格擬合到斷層掃描圖片中，能夠很好地與基質(zhì)蛋白層的密度厚度相吻合，這說明本研究的二維M1晶格很好地模擬了真實(shí)狀態(tài)下感染顆粒中的基質(zhì)蛋白層。
　　有研究表明，ISAV的NS1和M2都是I型干擾素拮抗劑。而對(duì)于M1或NEP的特性認(rèn)識(shí)卻非常少。此外，之前的研究稱熱休克同源蛋白70

6、(Hsc70)能夠與流感病毒的M1和NEP蛋白相互作用，為病毒的核糖核蛋白（vRNP）通過vRNP-M1-NEP復(fù)合物的輸出提供幫助。因此，本研究檢測(cè)了在單獨(dú)表達(dá)或共表達(dá)的情況下，ISAV的M1、NEP蛋白以及Hsc70蛋白的細(xì)胞亞定位情況。同時(shí)，這三個(gè)蛋白的相互作用也用pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究的目的是闡明ISAV的M1蛋白和NEP蛋白以及細(xì)胞的Hsc70的亞細(xì)胞定位以及相互作用。結(jié)果表明:當(dāng)M1、NEP以及Hsc70蛋

7、白單獨(dú)表達(dá)在雜交鱧(SSN-1)細(xì)胞中時(shí)，發(fā)現(xiàn)M1是同時(shí)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的，NEP則是只定位在細(xì)胞質(zhì)中并且在細(xì)胞核周圍聚集，而Hsc70是遍布在細(xì)胞質(zhì)中且細(xì)胞核中沒有。當(dāng)這三個(gè)蛋白兩兩共表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)M1和Hsc70都分別能夠與NEP共定位在細(xì)胞質(zhì)中并聚集在細(xì)胞核周圍。而M1和Hsc70共表達(dá)時(shí)，其定位情況與單獨(dú)表達(dá)時(shí)類似。與此同時(shí)，本研究還進(jìn)行了pull-down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證三個(gè)蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明，NEP能夠分別與M1