雞傳染性貧血檢測方法的建立及雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究.pdf

1、雞傳染性貧血病毒(CAV)是一種獨(dú)特的環(huán)狀單鏈(負(fù)鏈)無囊膜DNA病毒，該病毒廣泛存在于世界所有家禽生產(chǎn)國家，是青年雞群發(fā)生傳染性貧血綜合癥的病因。CAV感染后可導(dǎo)致再生障礙性貧血及全身淋巴組織萎縮，并伴隨嚴(yán)重的免疫抑制，常繼發(fā)病毒、細(xì)菌及真菌性感染，成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體之一。因此，CAV診斷的標(biāo)準(zhǔn)化工作顯得十分重要。
　　 1.雞傳染性貧血檢測方法的建立
　　 本研究參照GenBank發(fā)表的CAV Cux-1序列

2、設(shè)計(jì)一對引物，對感染MSB1細(xì)胞中的CAV進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，對影響擴(kuò)增的各個條件進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明PCR方法可以從陽性CAV病料中擴(kuò)增出長度為580bp的特異片段，特異性試驗(yàn)證明，該方法不能擴(kuò)增ALV、REV、MDV、NDV等基因組核酸，而只能擴(kuò)增CAV基因組核酸，顯示其具有較好的特異性；敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的PCR方法最低可以檢測到3.98個TCID50的病毒，形成了CAV檢測國家標(biāo)準(zhǔn)上報(bào)稿。隨機(jī)抽取9份市場

3、疫苗，用建立的PCR方法檢測CAV污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2份陽性，提示市場疫苗的質(zhì)量不容忽視。
　　 以感染CAV海安株的MSB1細(xì)胞為抗原，固定于玻片上，以CAV免疫SPF雞的多抗血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體為二抗，建立了檢測CAV抗體的IFA方法。研究結(jié)果表明，感染CAV的MSB1細(xì)胞只與CAV多抗反應(yīng)，與ALV、NDV、AE、IBDV多抗均不反應(yīng)，證明該檢測方法具有較好的特異性；敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法較中和試

4、驗(yàn)敏感性低。
　　 2.雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究
　　 將64只1日齡SPF雞隨機(jī)分為攻毒組(32只)及對照組(32只)，攻毒組每只雞胸部肌肉接種200μL CAV海安株病毒懸液(TCID50=10-4.6/50μL)，對照組接種等量1640培養(yǎng)基。結(jié)果接種病毒雛雞呈現(xiàn)特征性的臨床癥狀(貧血)，并伴有精神沉郁、食欲減退、羽毛蓬松等癥狀，第16天癥狀最顯著并出現(xiàn)死亡，20天后逐漸恢復(fù)。分別于接種病毒后第4、8、12

5、、16、20、24、28天撲殺雛雞，采集胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、骨髓、胰臟等組織，準(zhǔn)確稱重胸腺、肝臟、脾臟和法氏囊并進(jìn)行組織切片觀察，用PCR方法檢測不同階段病毒在各組織中分布情況。結(jié)果表明，雛雞攻毒后12至16天，胸腺、法氏囊生長受到嚴(yán)重抑制，脾臟指數(shù)無明顯變化，肝臟則較對照組腫脹；組織切片結(jié)果顯示，第8-16天可在胸腺、脾臟組織切片內(nèi)觀察到嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞缺如，肝臟則表現(xiàn)出細(xì)胞腫脹、肝竇間隙擴(kuò)張等病理變化，法氏囊淋巴細(xì)胞

6、缺如不顯著。PCR檢測結(jié)果顯示，肝臟和胸腺中病毒滴度均在攻毒后第16天達(dá)到最高，從第4天至28天在雞的心、肝、法氏囊、骨髓中均可檢測到病毒，胸腺和脾臟攻毒后24天內(nèi)PCR均為陽性，隨后檢出率降低；腎臟攻毒后16天內(nèi)PCR均為陽性，隨后檢出率逐漸降低。血清中病毒檢出率從攻毒后4天開始逐漸升高，12天到達(dá)高峰，在20天時不能被檢出。IFA抗體檢測結(jié)果顯示，攻毒后至第24天可檢測到抗體，少量CAV感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光，但28天開始CAV感染

7、細(xì)胞呈現(xiàn)大量特異性熒光，32天呈現(xiàn)強(qiáng)熒光；病毒中和試驗(yàn)(VN)檢測雛雞血清中和抗體水平結(jié)果顯示，攻毒后第16天可從血清中檢測到低滴度的抗體(1∶32-1∶64)，第28天抗體滴度上升(1∶512-1∶1024)，第32天產(chǎn)生較高滴度中和抗體(＞1∶1024)。
　　 綜上所述，本研究建立的雞傳染性貧血PCR和IFA診斷方法具有較好的特異性和靈敏性，并且具有快速、簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于雞傳染性貧血快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。CAV