傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)ORF125的功能研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)屬于虹彩病毒科(iddoviridae)腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus),是導(dǎo)致鱖(Siniperca chuatsi)暴發(fā)性死亡的重要病原,給我國(guó)鱖養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室于2001年成功完成了ISKNV全基因組序列測(cè)定、ORF劃分和序列分析工作,為ISKNV基因進(jìn)行更深入研究奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)

2、生物信息學(xué)分析,在ISKNV基因組中存在多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列家族基因(ankyrin repeat gene familyprotein),這些基因在ISKNV感染中的作用尚未清楚.本論文選取了其中一個(gè)錨蛋白重復(fù)序列家族基因ORF125進(jìn)行功能研究。
　　 本文首先通過(guò)RACE技術(shù)成功獲得了ISKNV ORF125基因的cDNA序列,并對(duì)ORF125的翻譯起始點(diǎn)位置進(jìn)行了更正。更正后的ORF125大小為825bp,編碼大小為29.

3、4kDa的蛋白。同時(shí)制備了ORF125蛋白的抗體,并以此抗體進(jìn)行Western blot,證實(shí)了ORF125蛋白在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。ISKNV感染后ORF125的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析表明,ORF125為晚期基因。
　　 通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn),我們從斑馬魚(yú)(Danio rerio)總蛋白中鑒定出一個(gè)可與ORF125蛋白在體外結(jié)合的蛋白IKKβ。通過(guò)簡(jiǎn)并引物和RACE的方法,克隆了鱖IKKβ,并對(duì)此基因進(jìn)行了序列的分析和特性的鑒定

4、。隨后,我們采用免疫共沉淀的方法證實(shí)ORF125蛋白與IKKβ的相互作用。由于IKKβ是NF-κB信號(hào)通路的重要分子,我們借助人類(lèi)細(xì)胞系統(tǒng)深入研究了ISKNV ORF125與NF-κB的關(guān)系。首先通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ORF125蛋白可抑制TNFα和PMA對(duì)NF-κB的激活,但對(duì)AP-1信號(hào)影響不大。Western blot檢測(cè)也顯示ORF125蛋白可抑制IκBα的磷酸化和NF-κB的核轉(zhuǎn)位。綜合這些結(jié)果表明ISKNVORF

5、125蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路的靶點(diǎn)在IKK復(fù)合物處。另外,我們采用免疫共沉淀的方法,從293T細(xì)胞總蛋白中找到ORF125的另一相互作用的蛋白GSTP1,推測(cè)ORF125可能是一個(gè)多功能基因。
　　 為探尋ISKNV ORF125在實(shí)際感染過(guò)程中的作用,本文進(jìn)一步研究了ISKNV與宿主NF-κB的關(guān)系。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NF-κB調(diào)控的基因IL8、TNFα、CC型趨化因子和IL-1β在ISKNV感染過(guò)程中的表達(dá)水平,我們