豬傳染性胃腸炎病毒非結構蛋白基因及非編碼區(qū)的克隆與分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病原之一。近年來，雖然國外有1株TGEV全序列測定及基因結構特征的報道，但國內對TGEV的研究著重放在結構蛋白基因上，對非結構蛋白基因及非編碼區(qū)的研究尚沒見報道。為了全面解析TGEV的分子結構特征，填補國內流行毒株在此方面的空白，本研究以TGEVTS株感染的豬腸溶物為材料，參照GenBank中TGEVPurdue株全序列，對TS株ORF1(聚合酶基因)、ORF3、ORF7、5'非編

2、碼區(qū)和3'非編碼區(qū)設計13對特異性引物，經過RNA提取、RT-PCR、以及重組質粒鑒定及陽性菌的測序等步驟完成了該病毒非結構蛋白及非編碼區(qū)的序列測定，并利用DNAstar、RNAdraw等軟件對TGEVTS株與其他毒株以及其他冠狀病毒非結構蛋白核苷酸及氨基酸序列進行分析。其主要結果如下： 1.本研究是我國首次對TGEV非結構蛋白基因及3'、5'非編碼區(qū)進行克隆和分析，結合本實驗室已測出的結構蛋白基因，測定出了TGEVTS全基因序

3、列，并登陸Genbank，登陸號為DQ201447，該序列為國內首株測出的TGEV全基因序列，也是Genbank中第2株登陸的TGEV全序列。 2.TGEVTS株聚合酶基因長為20054bp，由ORF1a和ORF1b組成。TS株與Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.8﹪和99.0﹪，與其他冠狀病毒如FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分別為88﹪、57﹪、57﹪和45﹪。不同冠狀

4、病毒比較結果顯示，聚合酶蛋白基因中RdRp、Hel、UP2、UP3蛋白基因較為保守。序列分析發(fā)現TS株在ORF1a和ORF1b重疊區(qū)有核糖體剪切位點UUUAAAC，且相應區(qū)域RNA二級結構形成3個莖環(huán)結構。 3.TS株ORF3和ORF7長分別為1487bp和516bp，ORF3與CHV(Miller)株、Puedue株核苷酸序列同源性分別為99.3﹪、97.9﹪，相應的ORF3a氨基酸同源性分別為97.3﹪、87.8﹪，ORF3

5、b氨基酸的同源性分別為98.4﹪、96.3﹪。TS株ORF7沒有發(fā)生堿基缺失，其與CHV株、Puedue株ORF7核苷酸序列同源性分別為100﹪、96.2﹪，。研究結果表明非結構蛋白高變區(qū)在ORF3a第192個堿基至終止密碼子之間。結果顯示TGEV和PRCV在編碼ORF3b氨基酸的數量和RNA酶結合位點上有差異。 4.TGEVTS株5'和3'非編碼區(qū)分別為319bp和280bp，5'非編碼區(qū)端第117～129核苷酸推導4個氨基酸