傳染性法氏囊病病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究.pdf

1、本研究以原核表達(dá)的VP5蛋白為免疫原制各特異性單克隆抗體，為試驗(yàn)研究建立細(xì)胞系提供檢測方法；成功構(gòu)建了IBDVVP5基因的真核表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的Veto E6細(xì)胞系，為深入研究VP5對病毒復(fù)制和致病力的影響奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-Gx(+12aa)VP5、pET28a-GxVP5、pET28a-GtVP5分別轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下均成功表達(dá)了24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-

2、VP5融合蛋白，并都以包涵體形式存在。將Gx-VP5純化后的蛋白免疫8周齡BALB/c鼠，ELISA分析表明制備的抗血清效價(jià)在1∶25600以上，Western blot分析VP5表達(dá)產(chǎn)物能與抗6xHis mAb及抗mDV多克隆抗血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的免疫反應(yīng)特異性；以原核表達(dá)的融合蛋白pET30a-GxVP5作為抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞常規(guī)融合，獲得了4B4、6D12、3E8三株能穩(wěn)定分泌抗

3、IBDV VP5的雜交瘤細(xì)胞株，亞類鑒定均為IgG1型，以三株雜交瘤細(xì)胞制備的腹水ELISA效價(jià)分別為5×10<'4>、3.5×10<'4>、3×10<'4>，特異性實(shí)驗(yàn)表明三株單抗能與IBDV Gt株反應(yīng)，以單抗介導(dǎo)的間接免疫熒光檢測表達(dá)Gt-VP5的Vexo E6細(xì)胞，可以見到特異的熒光；構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Gt VP5，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下導(dǎo)入Vero E6細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用有限稀釋法獲取亞克隆