油桐種子EST文庫(kù)構(gòu)建及FAD2等重要基因全長(zhǎng)cDNA克隆.pdf

1、油桐是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，所產(chǎn)桐油經(jīng)濟(jì)價(jià)值特高，廣泛應(yīng)用于高級(jí)油漆、涂料、油墨等制造業(yè)，又可供制生物柴油、樹(shù)脂、人造橡膠、皮革、塑料、顏料及醫(yī)藥等。油桐種質(zhì)資源是我國(guó)特有的基因資源，在基因表達(dá)水平開(kāi)展對(duì)油桐品質(zhì)及產(chǎn)量形成相關(guān)基因的研究，對(duì)油桐分子育種具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本文以油桐對(duì)年桐品種為試材，構(gòu)建種子cDNA文庫(kù)、EST文庫(kù)，并對(duì)EST序列進(jìn)行全面分析，對(duì)重要基因全長(zhǎng)cDNA克隆等方面進(jìn)行了研究，主要結(jié)果有:
　

2、　 (1)油桐近成熟種子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。采用Unizol方法提取總RNA，經(jīng)OligotexmRNAkit分離并純化得到mRNA，在SuperSciptTMⅡRnaseH-ReverseTranscriptase等的作用下合成cDNA，與pBluescriptⅡSK(+)XR載體連接重組并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10B，成功地構(gòu)建了油桐對(duì)年桐近成熟種子的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)總?cè)萘繛?.53×106，重組率為88.95％，插入片段長(zhǎng)度500

3、-1500bp。構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量高，為進(jìn)一步建立油桐EST文庫(kù)、開(kāi)展基因分離鑒定、制作油桐基因芯片和基因表達(dá)檢測(cè)等奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 (2)油桐近成熟種子EST文庫(kù)的構(gòu)建。以構(gòu)建的油桐對(duì)年桐近成熟種子cDNA文庫(kù)為材料，隨機(jī)挑選3203個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行5'端測(cè)序，獲得了具代表性的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。經(jīng)分析、整理，獲得3202有效EST序列，平均長(zhǎng)度554bp，500-700bp的ESTs占73.6％;在線CAP3拼接，共獲得

4、876個(gè)非冗余基因序列，其中重疊群202，單一EST序列674。重疊群的EST拷貝數(shù)從2個(gè)到106個(gè)不等，拷貝數(shù)為2的最多，達(dá)81個(gè);拷貝數(shù)為3的有29個(gè);拷貝數(shù)7個(gè)以上的出現(xiàn)頻率多為1或2。油桐對(duì)年桐品種的EST文庫(kù)系國(guó)內(nèi)首次構(gòu)建，為油桐功能基因組及遺傳改良等的進(jìn)一步研究提供了資源基礎(chǔ)。
　　 (3)油桐EST序列功能注釋。3202個(gè)有效EST序列中，1954個(gè)為功能已知基因序列，423個(gè)為功能未明確的基因序列，760個(gè)為相似

5、性較低的基因序列，44個(gè)為沒(méi)有重要相似性的基因序列，21個(gè)非植物類基因序列。1954個(gè)功能已知的基因序列中，非冗余基因序列467個(gè)，包括重疊群序列176個(gè)，單一序列291個(gè)，涉及379種功能基因;其中與油桐本種同源的序列133個(gè)，與同屬千年桐同源的序列349個(gè);與大戟科變?nèi)~木等11種植物同源的序列1347個(gè)。與其他科屬植物同源的序列125個(gè)。
　　 (4)油桐種子EST文庫(kù)已知功能基因表達(dá)分析。油桐近成熟種子表達(dá)的379個(gè)已知功

6、能基因歸為物質(zhì)代謝、能量代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)定位與貯藏、載體、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病與防衛(wèi)、次生代謝及未分類基因等12大類，蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)最豐富，占49.6％，蛋白質(zhì)定位與貯藏蛋白相關(guān)基因占21.9％，抗病和防衛(wèi)相關(guān)基因占8.1％;其他各類的相關(guān)基因表達(dá)量均不足5％。說(shuō)明材料采集時(shí)油桐種子正處蛋白質(zhì)合成與貯藏高峰期。其中與脂肪酸代謝相關(guān)的功能基因有△12油酸脫飽酶(FAD2)、β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ

7、(KASI)、烯脂?；；d體蛋白還原酶(EAR)、參與檸檬酸穿梭的蘋(píng)果酸脫氫酶、2，4-二烯脂酰CoA還原酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶、脂肪酸β-氧化多功能蛋白等，其中△12油酸脫飽酶(FAD2)基因?qū)俑哓S度表達(dá)。與油脂貯藏相關(guān)的油體蛋白Oleosin基因高豐度表達(dá)。與貯藏蛋白相關(guān)的基因有蛋白A3前體、豆球蛋白B前體、(11)S球蛋白β亞基前體、豆球蛋白類蛋白、種子貯藏蛋白等，多為高豐度表達(dá)。與抗性相關(guān)的基因35種，主要有金屬硫蛋白、熱

8、激蛋白、親環(huán)素、脫水素、翻譯控制腫瘤蛋白、富含脯氨酸蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等高豐度表達(dá)的基因。與能量代謝相關(guān)的基因主要有果糖二磷酸醛縮酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸葡萄糖變位酶、二氫硫辛酰胺脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶等低豐度表達(dá)的基因。與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因64種，主要有18S核糖體RNA、26S核糖體RNA、小亞基核糖體RNA、30S核糖體蛋白、40S核糖體蛋白、50S核糖體蛋白、60S核糖體蛋白、翻譯起始因子等;與氨基酸代謝相關(guān)的

9、序列4條。與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)基因17條，主要有前折疊素相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、泛素等。與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因序列32條，涉及23種功能基因。與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因序列36條，涉及24種功能基因。與次生代謝相關(guān)基因23種44條序列。與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因序列23條。
　　 (5)油桐FAD2基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。所克隆的FAD2基因序列長(zhǎng)1537bp，含長(zhǎng)度為1146bp的完整編碼序列，編碼383個(gè)氨基酸。其氨基酸序列有3個(gè)多變區(qū)，

10、N端的起始段6個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，3個(gè)組氨酸簇高度保守。酶蛋白分子量44144.4Da，等電點(diǎn)pI8.57，有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明FAD2為膜結(jié)合酶，在N端、C端及中間各有一強(qiáng)親水區(qū)，為膜外結(jié)構(gòu)區(qū);中間若干區(qū)段為疏水區(qū)，為膜內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)，組氨酸簇位膜表面，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋主要位于肽鏈C端，β折疊鏈較短，卷曲主要位于肽鏈N端。
　　 (6)油桐核糖體蛋白及rRNA基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。60S核糖體蛋白L8的基因序列長(zhǎng)1086bp，

11、含有長(zhǎng)783bp的完整編碼序列，編碼261個(gè)氨基酸。氨基酸序列近N端和近C端高度保守，C端尾部變化較大。酶蛋白分子量28175.3Da，pI11.44，為堿性蛋白。N端、C端各具強(qiáng)親水性，中間則親水區(qū)與疏水區(qū)相間。二級(jí)結(jié)構(gòu)上，卷曲主要位于肽鏈的中部，β折疊鏈較短，α螺旋較少，主要位于N端和C端。18SrRNA基因序列全長(zhǎng)2523bp，26SrRNA基因序列長(zhǎng)2933bp。不同產(chǎn)地和不同生存環(huán)境的物種，其rRNA基因有不同的堿基組成，親緣

12、關(guān)系越近的物種間堿基相似性越大，構(gòu)建rRNA基因進(jìn)化樹(shù)是檢測(cè)物種基因同源性和鑒別物種有力的輔助工具。26SrRNA和18SrRNA分別參與到核糖體大小亞基的自組裝形成中，rRNA分子內(nèi)有大量的反向互補(bǔ)序列，形成大量局部雙鏈區(qū)并自卷曲和折疊而形成穩(wěn)定的“莖環(huán)狀”結(jié)構(gòu)。rRNA分子結(jié)構(gòu)有大量鏈內(nèi)雙鏈區(qū)，雙鏈間有較小的內(nèi)凸環(huán)，側(cè)凸環(huán)成鏈的拐點(diǎn)，較大環(huán)則成為雙鏈定向的環(huán)島，雙鏈末端為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，呈長(zhǎng)臂狀的“吸臂”，這有利于rRNA分子與核糖體蛋白