鳳丹脂肪酸去飽和酶基因PoFAD2的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、鳳丹（Paeonia ostii T. Hong& J. X. Zhang）隸屬于芍藥科芍藥屬，屬于油用牡丹，是一種重要的新型油料作物。根據(jù)測(cè)定，鳳丹籽油中不飽和脂肪酸尤其是亞麻酸（l inolenic acid，LNA）及亞油酸（linoleic acid，LA）的含量較高，二者均由油酸（oleic acid，OA）脫氫而來(lái)。在不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）合成過(guò)程中，脂肪酸去飽和酶FAD2（fa

2、tty acid desaturase2）基因控制編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的油酸去飽和酶，它是植物體內(nèi)合成多不飽和脂肪酸的限速酶。分離油料植物中FAD2基因并研究其表達(dá)模式，已成為該領(lǐng)域科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。然而，迄今為止對(duì)于鳳丹FAD2基因的研究尚未報(bào)道。因此研究鳳丹中FAD2，對(duì)于進(jìn)一步了解該基因的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控方式等具有重要研究意義，同時(shí)也將為通過(guò)基因工程調(diào)節(jié)鳳丹種子中各不飽和脂肪酸的含量奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以鳳丹胚珠為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)

3、用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆出鳳丹脂肪酸去飽和酶基因PoFAD2的全長(zhǎng)cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法分析了該序列及其編碼蛋白的生物學(xué)特性，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和2-ΔΔCT法定量分析了該基因在不同器官組織及種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，此外，還對(duì)種子發(fā)育進(jìn)程中4個(gè)時(shí)期的脂肪酸含量進(jìn)行了測(cè)定。主要研究結(jié)論如下：
　?。?）鳳丹脂肪酸去飽和酶基因：首次從鳳丹中克隆出一個(gè)全長(zhǎng)為1712 bp的脂肪酸去飽和酶基因PoFAD2的cDN

4、A序列，該序列包括一個(gè)1152 bp的完整開放閱讀框，5’非編碼區(qū)277 bp，3’非編碼區(qū)261 bp（不包括polyA尾巴），共編碼383個(gè)氨基酸。
　?。?）鳳丹脂肪酸去飽和酶基因PoFAD2編碼蛋白：該基因編碼蛋白的分子式為 C2070H3033N527O540S14，相對(duì)分子質(zhì)量為44389.9 Da，理論等電點(diǎn)PI值為7.10；不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）為40.12（>40），為不穩(wěn)定蛋白；總平均

5、疏水指數(shù)（Grand average of hyd-ropathicity，GRAVY）為-0.122，偏親水性；不含信號(hào)肽，屬于膜整合蛋白，且為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的酶；該蛋白中共有4個(gè)跨膜區(qū)，分別位于55~77位、178~200位、223~245位、250~272位，其中第4個(gè)跨膜區(qū)的疏水性較強(qiáng)；該蛋白主要包括一個(gè)脂肪酸去飽和酶所共有的保守功能域，即△12-脂肪酸去飽和酶型結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，共含有3個(gè)高度保守的組氨酸簇，其可富集二價(jià)鐵離子，

6、是PoFAD2酶的催化活化中心；該基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（α-helix）、無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）和β-折疊（β-Sheet）分別占36.55％、31.85%和21.93%；而β-轉(zhuǎn)角（β-turn）則占9.66%，散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中；與其他植物有較高的同源性和親緣關(guān)系，其中與芍藥的同源性和親緣關(guān)系最近，符合物種進(jìn)化規(guī)律，預(yù)示著脂肪酸去飽和酶基因FAD2在進(jìn)化中維持著較保守的結(jié)構(gòu)和功能。
　　（3）鳳丹脂肪酸去飽

7、和酶基因PoFAD2的表達(dá)分析：在不同器官組織間具有表達(dá)差異性，在胚珠中高表達(dá)，推斷其為種子特異表達(dá)型；在種子發(fā)育進(jìn)程中，3個(gè)（品）種中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，均為升-降-升，且75 d處均達(dá)到表達(dá)量最高峰。
　?。?）鳳丹種子發(fā)育進(jìn)程中脂肪酸含量測(cè)定：隨著PoFAD2基因的不斷表達(dá)，花后100 d時(shí)不飽和脂肪酸達(dá)到最高含量，飽和脂肪酸達(dá)到最低含量；在花后50 d到75d期間，PoFAD2基因的表達(dá)量變化幅度與油酸、亞油酸及亞麻酸含量