甘藍(lán)型油菜脂肪酸延長(zhǎng)酶1基因FAE1的克隆、載體構(gòu)建、原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因擬南芥的初步研究.pdf

1、植物油是重要的農(nóng)產(chǎn)品之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在植物油中存在的脂肪酸有上千種。進(jìn)幾十年來(lái)，人們?cè)谠S多油料作物脂肪酸成分改造方面取得了巨大的成果。通過(guò)經(jīng)典的育種技術(shù)，如誘變，篩選，雜交等方法來(lái)獲得一些應(yīng)用價(jià)值高，性狀優(yōu)良的作物品系。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，油料作物特別是油菜中許多參與各種脂肪酸合成的酶的基因相繼被分離和克隆，這樣就加快了我們對(duì)油菜的脂肪酸成分改造的步伐。 芥酸(erucic acid，C22:1，△13)屬

2、于超長(zhǎng)鏈脂肪酸(very Long chainfattv acid，vLCFAs)。天然的油菜通常富含芥酸(通常為45％一60％)(MarenRossak等，2001)。而植物芥酸的合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脂肪酸延長(zhǎng)酶l(Fatty AcidElongase l)的作用下進(jìn)行的。通過(guò)對(duì)擬南芥超長(zhǎng)鏈脂肪酸突變體的遺傳學(xué)研究認(rèn)為18碳以上的脂肪酸的延長(zhǎng)可能受到FAEl基因的調(diào)控。因此要通過(guò)基因工程改變芥酸的含量無(wú)疑要借助于對(duì)該延長(zhǎng)酶基因的調(diào)控。

3、 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從高芥酸含量的甘藍(lán)型油菜基因組中獲得FAEl(脂肪酸延長(zhǎng)酶1)全長(zhǎng)的編碼序列，構(gòu)建真核生物表達(dá)載體pBIl21以及包含反向插入片段的載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入擬南芥和油菜，以期獲得FAEl基因高表達(dá)量和通過(guò)同源序列的干擾抑制作用從而產(chǎn)生的低表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株。 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的十字花科植物脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶基因FAEl序列，運(yùn)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了引物，并以從甘藍(lán)型油菜葉片中提取的總D

4、NA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1380bp的片段。序列克隆到pMDl8-T載體上，并同時(shí)挑出兩種方向插入片段的重組子。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Genbank比對(duì)證實(shí)該片段與植物中已知的FAEl序列有極高的相似性，并且不存在內(nèi)含子區(qū)域，表明該片段也可能通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體從而在大腸桿菌中得到表達(dá)。 通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶PstI和EcoRI雙酶切兩種pMDl8-T載體重組質(zhì)粒，將得到的兩種方向的FAEI片段分別定向插入到pBIuescript

5、SK質(zhì)粒中，得到了含有不同方向的FAEI片段的pSK質(zhì)粒重組子。 通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶Xbal和Smal雙酶切上述兩種pSK重組質(zhì)粒，將得到的兩種方向的FAEI．片段分別定向插入到pBll21質(zhì)粒中，則得到分別含有正向插入和反向插入FAEI基因的pBll2l真核表達(dá)載體。 將這兩種pBI121重組質(zhì)粒以及負(fù)對(duì)照含有GUS基因的pBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHl05，并轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，研究脂肪酸延長(zhǎng)酶1FAEl的功能。

6、 根據(jù)載體序列和FAEI片段的序列設(shè)計(jì)了含有EcoR工酶切位點(diǎn)的引物，利用PftJ高保真酶做PCR擴(kuò)增得到了5’端含有EcoRI酶切位點(diǎn)而3’端為平端的FAEI片段，EcoRI酶切消化5’末端并插入到改造自pGEX-2T載體的GTK載體的EcoR I和Smal多克隆位點(diǎn)之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞，28℃時(shí)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了與理論值相符合的76KD的GST融合蛋白。Western-blotting印跡分析顯示，

7、表達(dá)的融合蛋白能被抗GST抗體識(shí)別。 在對(duì)GST融合蛋白的初步純化中發(fā)現(xiàn)：不論是改變IPTG濃度還是降低培養(yǎng)溫度，融合蛋白均以不溶性的包涵體形式存在。選擇對(duì)細(xì)胞毒副作用小的0.1mM的IPTG和誘導(dǎo)溫度28℃進(jìn)行表達(dá)。超聲波破碎菌體分離包涵體，并洗滌和用含8M的尿素的緩沖液來(lái)溶解包涵體。通過(guò)親和層析分離純化出目標(biāo)蛋白后，可進(jìn)一步進(jìn)行功能和基因工程方面的研究。 另一方面，將FAEl基因插入帶有6×His標(biāo)簽的pQE-30原